2022 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis on protein phosphatases that regulate turnover of ethylene biosynthesis ACC synthase
| Project/Area Number |
21H02185
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
森 仁志 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20220014)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | エチレン生合成 / タンパク質ホスファターゼ / ACC合成酵素 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
トマトACC合成酵素(SlACS)を脱リン酸するprotein phosphatase PP2Aを同定する予定だった。特にその中で脱リン酸する基質を決めるPP2AのBサブユニットを同定する必要がある。これまでのアラビドプシスの解析から、Bサブユニットの中でも、B”サブユニットグループが候補となった。ここで本来の目的であるトマトのPP2Aに材料を変えた。B”サブユニットグループ内に5つのサブユニットがあり、どのサブユニットが結合するか明らかにする必要があった。これらのB”サブユニットcDNAをクローニングした。以前にyeast two hybrid systemで相互作用の検出を試みたが、うまくいかなかったのでACC合成酵素のタンパク質間相互作用を明らかにするために、AlphaScreen法で解析した。トマトSlACS2のC末端にはFlagアミノ酸配列を付加し、B”サブユニットタンパク質のN末端にmycアミノ酸配列を付加した。両タンパク質ともに小麦胚芽無細胞タンパク質合成系で合成し相互作用を解析したが、タンパク質間相互作用を明らかにすることができなかった。数年、ほとんど進展できていない。基本的にAlphaScreen法でタンパク質間相互作用を明らかにするために必要なタンパク質量が少ないのか、条件が適正でないのか依然として課題は残る。AlphaScreen法の場合、SlACS2をリン酸化状態でBサブユニットと反応させていない点が重大な問題である。元々PP2Aはリン酸化タンパク質を相手にするので、SlACS2をリン酸化酵素CDPKでリン酸化する、あるいはSlACS2のリン酸化されるセリン残基をアスパラギン酸残基に変換して擬リン酸化状態にして、タンパク質間相互作用を解析するという戦略を取ったが、こちらも成果が出ていない。残り一年間でこれらの点を解決しないといけない。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
概要に記載してあるが、タンパク質間相互作用を明らかにするためにAlphaScreen法を用いているが、うまく解決できていない。相互作用に必要な条件がかけているかもしれない。その一つは基質のSlACS2をリン酸化していない点が重要であるかもしれない。もう一つの問題はprotein phosphatase PP2AのBサブユニットが基質を認識するので、Bサブユニットを中心に考えてきたが、protein phosphataseが酵素活性をもつためにA, Cサブユニットも必要である。酵素活性を持つ状態にする必要があるかもしれない。この点を改良しないと結果がでないかもしれない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
ACC合成酵素を脱リン酸するprotein phosphataseはPP2Aである。PP2Aは3つのサブユニットA, B, Cから構成されている。Bサブユニットには基質を認識する調節機能がある。トマト果実で発現するPP2AのB"型（5種類）サブユニットを同定してあるので、これらのサブユニットと追熟果実で発現するアイソザイムSlACS2とSlACS4のBサブユニットをAlphaScreen法により解析し、ACC合成酵素を認識するBサブユニット候補を選抜する。トマトのACC合成酵素のアイソザイムは7種類以上あるが、追熟果実で発現するアイソザイムはSlACS2とSlACS4である。SlACS2はリン酸化されるが、SlACS4はリン酸化されない。それ以外のアイソザイムは全てリン酸化される。リン酸化されないSlACS4は実験上のネガティブコントロールとして相互作用を確認する。果実の追熟過程を考慮するとリン酸化SlACS2を認識するPP2Aを同定することが重要である。昨年度までの研究方向性と基本的に同じであるが、あまり成果が進まない。SlACS2に集中してきたが、接触によって誘導されるSlACS1AとSlACS6も同じ仕組みで代謝されるので、これらのアイソザイムとPP2Aサブユニットについても解析する。一方、PP2Aが基質リン酸化タンパク質をBサブユニットが認識する機構であると考えられているので、AサブユニットとCサブユニットの構成でPP2Aは機能する。これまでBサブユニットと基質の相互作用を解析してきたが、サブユニットA, B, Cで構成されたPP2AでAlphaScreen法により解析する計画である。
|
