2022 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of galactose carbohydrates regulating homing and differentiation of HSC in the bone marrow niche
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21H02389
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
浅野 雅秀 京都大学, 医学研究科, 教授 (50251450)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
成瀬 智恵 京都大学, 医学研究科, 准教授 (30372486)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ガラクトース糖鎖 / 造血幹細胞 / ホーミング / 血液細胞分化 / 骨髄ニッチ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）HSCのホーミングや分化の制御に関わる糖タンパク質とその糖鎖構造の解明
これまでのHSCの骨髄へのホーミングに必須のCXCR4の解析において，そのリガンドCXCL12との結合に重要なCXCR4のN末端の38アミノ酸に存在するN型糖鎖やO型糖鎖の付加可能部位にそれぞれ点変異を導入した変異型CXCR4を作製した。これを培養細胞に導入して，Wound healing assayとTranswell migration assayで遊走活性を測定したところ，２ヶ所のO型糖鎖の付加可能部位が重要であることがわかった。さらに，CXCR4の遊走活性シグナル伝達に関与するFAKなどのリン酸化が，この２ヶ所の変異で低下することがわかった。また，レクチンブロットやウエスタンブロット解析により，この２ヶ所にはO型糖鎖が結合していることが示唆された。そこでCRISPR/Cas9法を用いてCXCR4遺伝子にこの２ヶ所の変異を導入したマウスを作製中であり，目的のマウスが作製できたら，このマウスから調整したHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析する。
２）HSC特異的β4GalT-1欠損マウスの作製と解析
HSCや造血前駆細胞で特異的にCreを発現するVav-iCreマウスとβ4GalT-1 floxマウスの交配により，HSC特異的β4GalT-1欠損マウスを作製中である。このマウスのHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析することにより，ホーミング異常がHSCの糖鎖欠損によることを証明する。また，このマウスの骨髄細胞の分化段階をFACSで解析して，HSCの分化異常がその糖鎖異常に起因することを明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）HSCのホーミングや分化の制御に関わる糖タンパク質とその糖鎖構造の解明
CXCL12との結合に重要なCXCR4のN末端の38アミノ酸に存在する糖鎖の付加可能部位にそれぞれ点変異を導入してCXCL12への遊走活性を測定したところ，２ヶ所のO型糖鎖の付加可能部位が重要であることがわかった。さらに，CXCR4の遊走活性シグナル伝達に関与するFAKなどのリン酸化が，この２ヶ所の変異で低下することがわかった。また，レクチンブロットやウエスタンブロット解析により，この２ヶ所にはO型糖鎖が結合していることが示唆された。現在，CRISPR/Cas9法を用いてCXCR4遺伝子にこの２ヶ所の変異を導入したマウスを作製中であり，おおむね順調に進展していると判断した。
２）HSC特異的およびMEP特異的β4GalT-1欠損マウスの作製と解析
HSCや造血前駆細胞で特異的にCreを発現するVav-iCreマウスとβ4GalT-1 floxマウスの交配により，HSC特異的β4GalT-1欠損マウスを作製中であり，おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）HSCのホーミングや分化の制御に関わる糖タンパク質とその糖鎖構造の解明
CRISPR/Cas9法を用いてCXCR4遺伝子にこの２ヶ所の変異を導入したマウスを作製中であり，目的のマウスが作製できたら，このマウスから調整したHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析する。上記の実験がうまく進まない場合も想定して，すでに作製したCXCR4欠損マウスのHSCにレンチウイルスベクターを用いて変異型CXCR4を導入して，骨髄へのホーミング・生着能を解析する。
２）HSC特異的およびMEP特異的β4GalT-1欠損マウスの作製と解析
HSCや造血前駆細胞で特異的にCreを発現するVav-iCreマウスとβ4GalT-1 floxマウスの交配により，HSC特異的β4GalT-1欠損マウスを作製中である。このマウスのHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析することにより，ホーミング異常がHSCの糖鎖欠損によることを証明する。また，このマウスの骨髄細胞の分化段階をFACSで解析して，HSCの分化異常がその糖鎖異常に起因することを明らかにする。
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