2021 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of mechanisms for spindle bipolarization in mammalian oocytes
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21H02407
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
北島 智也 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (00376641)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 卵子 / イメージング / 紡錘体 / 染色体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、卵母細胞における紡錘体二極化の分子機構を明らかにすることを目的とする。昨年度までに、マウス卵母細胞における紡錘体二極化は動原体機能を必要とし、動原体はNdc80-Nuf2を介して微小管制御因子Prc1をリクルートすることで紡錘体二極化を促進することを明らかにしていた。
本年度の研究においては、まず紡錘体の二極化を定量的に評価する系を確立した。微小管重合中心MTOC（Cep192マーカー）や重合微小管プラス端（EB3マーカー）のライブイメージング画像を自動で解析し、紡錘体の二極化を評価する解析パイプラインを構築した。
次に、Ndc80-Nuf2とPrc1の相互作用について解析を行うため、in vitroでの再構築系を確立した。昆虫細胞・バキュロウィルス発現系を用いてNdc80-Nuf2複合体とPrc1のリコンビナントタンパク質を調整し、両者の相互作用を評価した。また、卵母細胞においてPrc1の動原体局在に必要なキナーゼについて、Ndc80-Nuf2やPrc1を基質としてリン酸化反応を行った。候補となるリン酸化サイトに変異を導入し、リン酸化の有無を検討した。また、これら変異型のタンパク質をマウス卵母細胞に発現させ、局在の評価を行った。
さらに、断片化したNdc80-Nuf2についてNdc80ノックアウト卵母細胞におけるレスキュー解析を行い、紡錘体二極化を促進する領域の同定を行った。ライブイメージングにより紡錘体二極化の過程を定量的に解析した結果、Ndc80-Nuf2-Prc1の経路以外にも紡錘体二極化を促進する経路が存在することが示唆された。これらの経路にMps1キナーゼが必要である可能性を含め、検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
計画のすべての項目で想定したとおりに研究が進展し、さらに予期せぬ紡錘体二極化の経路が存在することを示唆するデータを得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
動原体による紡錘体二極化の経路が複数あることを想定し、動原体の基礎的な機能である微小管捕捉と、動原体への微小管制御因子の集積が、紡錘体の二極化に協調的に働くかを検証していく。また、in vitroのNdc80-Nuf2とその相互作用因子の再構成系を用い、リン酸化などを介した相互作用制御の解析を進める。さらに、動原体に集積する微小管制御因子のスクリーニングを行う。
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