2022 Fiscal Year Annual Research Report
In-situ structural biology by NMR spectroscopy
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21H02419
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan University |
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Principal Investigator |
伊藤 隆 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (80261147)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
美川 務 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 専任研究員 (20321820)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | in-cell NMR / 蛋白質 / 立体構造 / ダイナミクス / 相互作用 / 液液相分離 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内の分子クラウディング環境は，蛋白質の生物活性のみならず，その立体構造やダイナミクスにも影響を与える．本研究ではin-cell NMRを用いて，細胞中蛋白質動態の詳細な理解を目指す．真核細胞内での，(1)蛋白質の立体構造・ダイナミクス，(2)マルチドメイン蛋白質のドメイン間相互作用，(3)蛋白質間相互作用，を解析するためには，in-cell NMR測定の様々な要素技術の高度化が必須である．In-cell NMRによって得られた立体構造，ダイナミクス，フォールディング安定性，蛋白質間相互作用を解析することで，細胞内分子クラウディング環境の普遍的な理解に挑戦する．
2022年の研究業績は以下の通り．
(1)細胞内蛋白質の立体構造・ダイナミクスの解析については，引き続き開発研究を進め，情報科学を駆使した自動NMRデータ解析で進展があった．GTP結合型RASの動的構造多形に対する細胞内環境の影響についても解析を開始した．また，植物培養細胞を用いたin-cell NMR解析も行った．
(2)細胞内マルチドメイン蛋白質のドメイン間相互作用の解析については，常磁性NMR情報を効率よく利用したPCS/PRE情報からの蛋白質立体構造計算手法の開発を進めた．モデル試料としてヒトユビキチンタンデム２量体を用い，ランタノイド結合タグによって常磁性中心を導入した．その後，HeLa細胞に導入し解析を行った．現在細胞内環境における構造アンサンブルの決定を行っている．
(3)細胞内蛋白質間相互作用の解析」ついては，クラウディング環境下で蛋白質間相互作用をとらえるための方法論的研究を継続して進めた．2021年から始めたGRB2とSOS1蛋白質の系に加えて，ショウジョウバエDrkとSosの相互作用の系も含めて解析を行い，それぞれの相互作用によって形成される液液相分離（LLPS）について解析を行った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では，溶液NMRの手法を用いて細胞中蛋白質動態の詳細な理解を目指すという目標に従って研究を行っている．本研究では，要素技術開発とそれらを用いた基礎・応用実証研究の2つの側面がある．
2022年度は当初計画に従って以下のように研究を進めた．
「要素技術研究」としては，バイオリアクターを用いた安定したin-cell NMR測定法，multi-state構造計算法の開発などで，顕著な進展があった．
また，新しい要素技術を用いた「基礎・応用実証研究」においても，タバコBY-2細胞を用いて，植物培養細胞のin-cell NMR測定法の開発を行い，植物由来蛋白質の「その場」解析につながる知見を得た．さらに，モデル試料にランタノイド結合タグを用いて常磁性中心を導入し，HeLa細胞中でPCS/PRE情報を観測するなど，最終年度につながる興味深い結果を得ている．
以上のことから，本研究は全体としておおむね順調に進展していると考えられる．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，計画の修正を適宜行いつつ研究を継続し，(1)細胞内蛋白質の立体構造・ダイナミクスの解析，(2)細胞内マルチドメイン蛋白質のドメイン間相互作用の解析，(3)細胞内蛋白質間相互作用の解析，についての研究を進めていく．
(1)については，2022年度までの方法論的研究を継続するとともに，応用実証研究として，GTP結合型RASの動的構造多形性，ヒトアデニル酸キナーゼ（hAK）のフォールディング安定性，などに対する細胞内分子クラウディング環境の影響の解析を行っていく．
(2)については，手法の開発を継続するとともに，ヒトユビキチンタンデム２量体や，GRB2（2つのSH3ドメインと１つのSH2ドメインを持つ）などについて，真核細胞内でin-cell NMR測定を行い，細胞内分子クラウディング下でのドメイン間相対配置の決定を行う．
(3)については，GTP結合型RASといくつかのエフェクター分子のRAS-bindin domainの相互作用，ヒトNrf2-Neh2ドメインとKeap1蛋白質の相互作用，などについて，細胞内分子クラウディング下での，複合体中でのそれぞれの蛋白質の相対的配置を特異的かつ詳細に観測することを目指す．
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[Journal Article] Structural and biochemical insights into heterotetramer formation of oncogenic K-Ras4BG12V and Rgl2, a RalA/B activator2022
Author(s)
Mishal Tariq, Teppei Ikeya, Naoyuki Togashi, Louise Fairall, Carlos Bueno-Alejo, Syun Kamei, Beatriz Romartinez-Alonso, Miguel Angel Muro Campillo, Andrew J. Hudson, Yutaka Ito, John W.R. Schwabe, Cyril Dominguez, Kayoko Tanaka
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Journal Title
bioRxiv
Volume: -
Pages: -
DOI
Open Access / Int'l Joint Research
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