2021 Fiscal Year Annual Research Report
病原菌ヘムトランスポーターの構造変化の追跡と基質輸送機構の解明
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21H02421
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
杉本 宏 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 専任研究員 (90344043)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 哲就 神戸大学, 理学研究科, 准教授 (70506906)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | トランスポーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
病原菌は宿主に感染した際に、血液ヘモグロビンから鉄をヘムの形で奪い取り、増殖に必要な栄養素として利用している。そのため、ヘムの取り込みは感染症を抑制する上でも注目されてきた。本課題では、グラム陰性の病原性細菌でアデノシン三リン酸（ATP）依存的にペリプラズム空間から細胞質へとヘムの膜輸送を行うABCトランスポーターの構造変化に着目する。これまでの当グループによる研究で明らかにした結晶構造からは、分子の中心を通る基質輸送チャネルに大きな構造変化が起こることが示唆されたが、ヘムやATPが結合した状態での構造は未だに決定できていないせいもあり、メカニズムの理解が全く進んでいない。本年度は、ヘムトランスポーターによるヘム輸送の仕組みの全容を解明するために、クライオ電子顕微鏡によって、ヘムの輸送過程の各構造のスナップショットを取得することを目指した。休止型の状態のトランスポーター（ペリプラズムヘム結合タンパク質：膜貫通サブユニット：ヌクレオチド結合サブユニットの1:2:2複合体）は比較的安定した状態であるため、試料調整方法の確立とデータ収集をおこなった。ヘム結合型の複合体の状態で界面活性剤を両親媒性ポリマーに置換することで可溶化状態を維持すると観察グリッド上での単分散性が向上することを見出した。凍結試料のクライオ電子顕微鏡観察を行なった結果、低分解能ではあるが5つのサブユニットの配置や２次構造が確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
高分解能データを得るためにはヘムトランスポーター複合体の粒子間の会合をなくして単分散状態とする必要があることから。複合体の精製方法、界面活性剤の種類やタンパク質濃度などの条件の最適化を進めてきた。その結果、単分散性の問題やヘムの占有率の問題を解決し高分解能の３次元解析のためのデータ収集へ展開する見通しが得られた状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
輸送基質であるヘムはその結合様式に依存して可視光の吸収スペクトル変化があるためヘム自身をプローブとして活用できる。したがって、ヘムの環境の変化を吸収スペクトルの変化によって検出できる。つまり、時間分解解析によってどのタイミングでヘムの結合と輸送と解離が行われているかを明らかにできると考えられる。また、ヘムの輸送過程における過渡的な状態をトラップするために、EPR分光法とアニーリング法による反応制御を組み合わせた解析を行う。
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