2021 Fiscal Year Annual Research Report
SARS-CoV2のタンパク質Nによる液滴とRNAタンパク質複合体の形成機構
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21H02438
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
高橋 聡 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (30283641)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | SARS-CoV2 / Nタンパク質 / 一分子蛍光分光法 / 蛍光相関分光法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
新型コロナウイルスは約3万塩基もの長さを持つRNAをウイルス内にコンパクトにパッキングし、遺伝情報として維持している。ウイルスにおいて、本来不安定なRNAを安定化しコンパクトに収縮させる役割を持つと考えられるのが、Nタンパク質である。本研究では、Nタンパク質とゲノムRNAがどのように構造形成を行うかを調べることを目的とした。
はじめに、Nタンパク質を精製する作業から研究を開始した。大腸菌を用いてNタンパク質を発現させたが、Nは凝集しやすく、多数の不純物を分離することが難しかった。一旦回収したインクルジョンボディーを徹底的に洗浄することで、比較的実験の再現性のよい試料を得ることができた。
次に、一分子蛍光分光法を用いて、短いRNA配列がNタンパク質とどのような相互作用を持つのかを調べる実験を開始した。用いた試料は、一本鎖構造を持つ40塩基のポリアデニル酸である。この試料の5'および3'末端を蛍光色素でラベル化し、さまざまな濃度のNタンパク質存在下における構造変化を一分子蛍光分光法により観察した。その結果、Nタンパク質がRNAに対して高い親和性を持ちRNAを収縮させることを見出した。さらに、同じ試料を蛍光相関分光法で調べる実験も開始した。
長鎖RNAの片末端を光学基板に固定化し、イメージングするための実験を試みた。しかし、基板にたいするRNAの吸着を完全に取り除くことが難しく、再現性よく片末端を固定することができなかった。このために多くの努力を費やしたが、この実験を行うことは断念した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
一分子分光測定のレーザーの交換を予定していたが、2021年度内のレーザーの購入が世界的な半導体不足の影響で困難だった。そのため、レーザー購入のための費用を繰越し、2022年度に購入する。これらの事情により、一分子蛍光観察の実験が遅れている。また、上述したように、RNAをイメージングする実験の実行は困難だった。これらの予想できない原因により、実験計画の遅れがあった。
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| Strategy for Future Research Activity |
第一に一分子蛍光測定による短いRNAの構造変化について、研究を完成させる。そのため、長さのことなるRNAを用いて、Nによる構造変化のデータを蓄積する。また、蛍光相関分光法を用いた測定も開始する。
第二に、Nタンパク質自身に蛍光色素をラベル化し、一分子蛍光測定を行う研究を開始する。
第三に、長鎖RNAをインビトロ合成し、Nタンパク質添加による構造変化を調べる研究を実施する。
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