2021 Fiscal Year Annual Research Report
Verification of "rotation model" of bacterial flagellar rotor with single-molecule analysis
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21H02454
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| Research Institution | Institute for Molecular Science |
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Principal Investigator |
飯野 亮太 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 教授 (70403003)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 分子モーター / １分子計測 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ビブリオ属菌由来のNaイオン駆動型PomABを用い、完全な複合体の効率的な精製と１分子計測に必要なタグの導入の検討に取り組んだ。初めに、PomAのC末に精製用His10タグ、PomBのN末付近のIDR領域に金ナノ粒子プローブ結合用Spy-tagを挿入したコンストラクトを試みたが、PomBの発現量が低く、PomAB複合体の精製は困難であった。次に、PomAのC末にHis10タグのみを導入したコンストラクトで詳細に検討し、PomAに導入したタグで精製すると、PomBを含まないPomAのみの複合体の混入が多くなることが判明した。そこで、PomBに精製用タグを導入したコンストラクトを作製して検討を行った。その結果、PomAのC末にHis10タグ、PomBのC末にStrepTagIIを導入したコンストラクトでStrepTagIIを用いて精製を行うことで、PomAとPomBの化学量論比の大幅な改善を達成した。
また、１分子計測の予備実験として、精製PomAB複合体のHis10タグによるNi-NTA修飾ガラス基板への特異的固定、およびStreptactinコート金ナノ粒子の特異的結合の有無を検証した。その結果、PomAB複合体の濃度依存的に、金ナノ粒子のガラス基板への結合数が増加することが確認された。他方、結合の絶対数はポジティブコントロールとして用いたHisタグビオチン化VoV1とストレプトアビジン修飾金ナノ粒子の系と比較し1/10程度であり、PomAのHisタグの位置の最適化を現在検討中である。
尚、以上の取り組みは、小嶋誠司博士（名古屋大教授）、錦野達郎博士（大阪大特任研究員）、本間道夫博士（名古屋大名誉教授）、寺島浩行博士（長崎大助教）を研究協力者とし緊密な連携の下で推進した。錦野博士は、本知見も活用し、クライオ電顕単粒子解析によるPomAB複合体の構造解析に成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画に従い、研究協力者の小嶋誠司博士らとの緊密な連携のもと、ビブリオ属菌由来のNaイオン駆動型PomAB複合体の遺伝子操作による変異体の作製、大腸菌を宿主とした発現と精製といった一連の実験系を、分子研の研究代表者の研究室で確立することができた。また、複数の精製用タグを導入することで完全なPomAB複合体の精製効率の改善に成功し、様々な金ナノ粒子プローブ結合用タグを試すことで、ガラス基板に結合させたPomAB複合体に金ナノ粒子プローブを特異的に結合させることに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、錦野博士が明らかにしたPomAB複合体の構造を参考に、精製用タグや金ナノ粒子プローブ導入位置のさらなる検討を行う。特に、Ni-NTA修飾ガラス基板への結合数を増加させるため、AlphaFold2を用いてモデリングを行ってHis10タグの前にαヘリックスを形成するアミノ酸をさらに追加し、Ni-NTA修飾ガラス基板へのHis10タグのアクセスを改善する。
また精製したPomAB複合体を脂質二重膜小胞（リポソーム）に再構成し、イオン輸送活性の測定を確立する。PomABとVoV1またはKR2を同時に再構成することで、ATPまたは光で電気化学ポテンシャルを形成可能にし、蛍光指示薬でリポソーム内部のNaイオンの濃度変化を検出する。PomAB を含まずVoV1、KR2のみを再構成したリポソームをコントロールとして比較することで、PomAB変異体のイオン輸送活性を評価する。
尚、界面活性剤で可溶化したPomAB、VoV1、KR2をリポソームに再構成する際、配向の制御が重要となる。そこで、親水性頭部に電荷を持つリン脂質を加えてリポソームを調製し、ポリヒスチジンタグを持つPomAB、VoV1、KR2の配向の制御を試みる。リポソームへの再構成法としては、凍結融解法、透析法、バイオビーズ法を試す。尚、VoV1のATP加水分解で電気化学ポテンシャルを形成する際は、リポソームの外側にATPを加える。この場合、V1部がリポソームの外側に配向したVoV1のみがATPを分解し、Naイオンの輸送は外部から内部への一方向となる。よって、VoV1の配向制御は必ずしも必須ではない。
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