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2023 Fiscal Year Annual Research Report

Verification of "rotation model" of bacterial flagellar rotor with single-molecule analysis

Research Project

Project/Area Number 21H02454
Research InstitutionInstitute for Molecular Science

Principal Investigator

飯野 亮太  分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 教授 (70403003)

Project Period (FY) 2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords分子モーター / 1分子計測 / べん毛
Outline of Annual Research Achievements

PomBは二次構造を取らない天然変性領域を持ち、構造が大きく揺らいでいると考えられている。天然変性領域の揺らぎは金ナノ粒子プローブを用いた1分子回転計測の障害となると予想される。そこで、当該領域を削ったΔ71-150変異体を新たに作製した。精製したΔ71-150変異体のI50C残基を蛍光色素Cy3マレイミドで標識して1分子蛍光観察を行い、PomAのC末にリンカーを介して導入したHis10タグとNi-NTA修飾したガラス基板の相互作用により、濃度依存的に特異的に結合することを確認した。また、精製したPomAB複合体試料のPomAとPomBの化学量論比の改善を目的として、PomBのC末にはStrepTagIIがこれまでに導入されている。そこで、金ナノ粒子の表面をストレプタクチンで修飾することで、このStrepTagIIに特異的に結合させることを試みた。しかしながら、現時点では明確な特異的結合が見られていない。現在、StrepTagIIをタンデムに2つ繋ぐことで改善を試みている。
さらに、精製したPomAB複合体を脂質二重膜小胞(リポソーム)に再構成し、Na+輸送活性の測定を試みた。Na+の蛍光性指示薬であるSoduim GreenをPomAB再構成リポソームに内包させ、外部溶液にNa+を加えることで蛍光強度の増加を蛍光分光光度計で計測した。しかしながらこれまでのところ、明確かつ有意な蛍光強度の増加は確認されていない。現在、PomAB複合体のリポソームへの再構成法(凍結融解法、透析法、バイオビーズ法)や内包させるSoduim Green の濃度等、実験条件の改善を試みている。また、Na+輸送性のV-ATPaseもコントロール実験の試料として用い実験を進めている。

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

  • Research Products

    (7 results)

All 2024 2023

All Journal Article (1 results) Presentation (6 results) (of which Int'l Joint Research: 4 results,  Invited: 6 results)

  • [Journal Article] インタビュー:分子マシン研究をリードするDavid A. Leigh博士2023

    • Author(s)
      David A. Leigh, 金原数, 飯野亮太
    • Journal Title

      現代化学

      Volume: - Pages: 28-32

  • [Presentation] Single-molecule imaging and engineering of biological and synthetic molecular motors2024

    • Author(s)
      Ryota Iino
    • Organizer
      CU-MU-IMS Faculty Exchange Meeting 2024
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 生体発動分子の展望と課題2023

    • Author(s)
      飯野亮太
    • Organizer
      シンポジウム「発動分子科学の展望と課題」
    • Invited
  • [Presentation] Autonomous unidirectional motions of biomolecular motors: the roles of structures and chemical fuels2023

    • Author(s)
      Ryota Iino
    • Organizer
      Okazaki Workshop on Molecular Machines 2023
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Single-molecule imaging and engineering of molecular motors2023

    • Author(s)
      Ryota Iino
    • Organizer
      The symposium "The molecular organization of living systems"
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Single-molecule imaging and engineering of molecular motors2023

    • Author(s)
      Ryota Iino
    • Organizer
      61th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan
    • Invited
  • [Presentation] Single-molecule analysis and engineering of molecular motor proteins2023

    • Author(s)
      Ryota Iino
    • Organizer
      The TSRC Workshop on Protein Dynamics
    • Int'l Joint Research / Invited

URL: 

Published: 2024-12-25  

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