2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of cell-cycle-regulated CRISPR/Cas system
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21H02469
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
近藤 一成 国立医薬品食品衛生研究所, 生化学部, 部長 (40270623)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柴田 識人 国立医薬品食品衛生研究所, 生化学部, 室長 (30391973)
為広 紀正 国立医薬品食品衛生研究所, 生化学部, 協力研究員 (80597881)
曽我 慶介 国立医薬品食品衛生研究所, 生化学部, 主任研究官 (50746336)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / DNA２本鎖切断 / CRISPR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，医療分野での安全や利用を目指して，細胞周期に応じて適切なゲノム編集活性を示す「細胞周期制御型CRISPR/Casシステム」を構築するために必要な基盤研究を行う.修復エラーが多い非相同末端結合修復を阻害し、細胞周期のG2M期への同調が編集効率と精度向上に有効であると考えられているが ，細胞周期の変化が生物自身のゲノムや細胞機能に与える影響は全く検討されていない。ヒト細 胞を用いてCRISPR/Casが各細胞周期で誘導するすべての変異と遺伝子発現変化を解析して，各細胞周期で最適な条件でゲノム編集を実行できる システムの確立を行う.細胞のDNA修復機能に手を加えず，最適な細胞周期条件でゲノム編集が実行されるシステム構築を行う.
１年目は、DNA２本鎖切断後の欠失が生じた細胞を蛍光検出できる、レポーター細胞の構築を行った。ヒト２倍体ゲノムのそれぞれのアレルをEmerald, 及び、Scarletで検出するためのドナーベクター作製を行った。また、一過性の遺伝子導入実験から、検出特異性を高めるためにもTetシステムで構築することが適切と考えられた。現在、RPE-1細胞へドナーベクターを導入して選抜を行っている。
また、ゲノム編集時における遺伝子発現変化を網羅的に検出するためにRNA-seqを実施した。全細胞を解析しているため、変化の検出は容易ではない。そのため、上記レポーター細胞構築後にDNA２本鎖切断後の欠失が生じた細胞のみを集めて解析することが必要と考えられた。
ゲノム解析で遺伝子変異を細胞を用いて検出するときに、参照配列と比較してゲノム編集前にすでに存在する変異をいかに除去するかは今後の研究で重要であることから、RPE-1細胞について、核培養条件下でゲノムDNAを抽出、ゲノム解析することで、GATK解析時のPanel of Normalデータセットを構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
レポーター細胞の構築が少し時間をようしているが、そのほかは計画通りに進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
レポーター細胞の構築を最優先に行う。構築後は、ゲノム編集処理における、DNA２本鎖切断やDNA修復における作用や、細胞周期のそれぞれで起きる現象を、ゲノム変異、遺伝子発現変化、タンパク発現変化などを解析することで明らかにする。
また、これまでの結果である、TK６細胞での得られた「G2/Mにおける制御がゲノムワイドな変異誘導を顕著に抑制すル」という結果を、今回の１RPE-1細胞でも確認するすることで、普遍的な現法であるかを検証する。
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