2022 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanisms of rigidity-dependent differentiation of mesenchymal stem cells
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21H02471
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
水野 健作 東北大学, 生命科学研究科, 名誉教授 (70128396)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 間葉系幹細胞 / 脂肪細胞分化 / アクチン骨格 / Rho / Rho-GEF / 力覚応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
間葉系幹細胞の基質の硬さ依存的な分化誘導の制御機構について、特に、基質の硬さによる機械的刺激に対する応答とアクチン骨格再構築の観点から研究を進めている。昨年度までに、間葉系幹細胞の脂肪細胞分化をモデルに、低分子量G蛋白質Rhoファミリーの活性化因子であるRhoGEFの網羅的な発現抑制スクリーニングを行い、脂肪細胞への分化を抑制、促進するGEFを多数見出した。本年度は、それらの結果の再現性を確認し、また、分化に対する影響の基準をより精査して脂肪細胞分化に関与するRhoGEFの候補を選別した。その結果、発現抑制によって脂肪細胞分化を促進するもの、すなわち分化の抑制に関与する可能性があるもの14種類と、発現抑制によって分化を抑制するもの、すなわち分化の促進に関与する可能性があるもの7種類を同定した。脂肪細胞分化を抑制するものの中でRhoAを活性化するGEFは9種類あり、一方、分化を促進するものにはRhoAのGEFはなかったことから、RhoAの活性化は脂肪細胞分化を抑制する傾向があることが示された。また、RhoAを標的としないRhoGEFで、分化を抑制するものと促進するものが見出された。特に、分化を促進する働きをもつものは、アクチン骨格の再構築制御を介して脂肪細胞分化を制御する可能性があり、新たなシグナル伝達機構の存在が示唆された。また、RhoAを標的とするGEFのうち5種類のAKAP13, ARHGEF10, ARHGEF11, ARHGEF15, ARHGEF40, BCRは機械刺激応答に関与することが示唆されており、これらのGEFが基質の硬さに依存した間葉系幹細胞の分化方向の決定に関与する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
間葉系幹細胞の脂肪細胞分化を指標としたRhoGEFの発現抑制による網羅的スクリーニングについて、不確定な部分を補完してほぼ終了することができた。同定されたRhoGEFについては、脂肪細胞分化に抑制的に働くと予想される14種のRhoGEFのうち９種はRhoAを活性化するものであり、RhoAが抑制的に働くとするこれまでの報告と一致した。また、その中には機械刺激応答に関与することが報告されている5種のRhoGEFも含まれていた。基質の硬さによる分化誘導の実験系は未だ確立できていないが、得られたRhoGEFの解析から基質の硬さによる分化制御について関連を解析することが可能であると考えられる。また、スクリーニングの結果を受け、間葉系幹細胞の基質の硬さの違いによって脂肪細胞分化の効率に違いを見出せることができるか検討を開始した。硬さの異なるアクリルアミドゲルの作製方法は確立しており、基質の硬さの違いによる間葉系幹細胞の形態とアクチン骨格構造の変化については確認している。また、今回のスクリーニングで見出したRhoGEFについて、過剰発現による影響を解析するために発現系の構築を開始した。脂肪細胞分化を促進する働きが予想されるGEFについては、それらのGEFの過剰発現による分化促進の可能性について検討を開始した。また、脂肪細胞分化の制御に働く蛋白質である転写共役因子のYAPの細胞内局在について、今回見出したRhoGEFの発現抑制と過剰発現による影響の検討を開始した。以上から、概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 間葉系幹細胞の分化に関与するシグナル伝達経路の解析：間葉系幹細胞の脂肪細胞分化誘導に関与するRhoGEFのスクリーニングの結果、分化の促進、または、抑制に働くことが予想されるものが多数同定された。この結果を受け、同定した各々のRhoGEFについてそのシグナル伝達経路と作用機序を解析する。特に、脂肪細胞分化を促進する鍵となる転写制御因子であるPPARγの発現や、分化を抑制する転写共役因子YAPの活性化や核局在に対する働きを解析する。また、過剰発現によって脂肪細胞分化を誘導するRhoGEFが見出された場合、そのRhoGEFは脂肪細胞分化を直接制御する可能性が高いため、近位依存性ビオチン標識法であるBioID法を用いたプロテオーム解析を行い、上流、下流で働く因子を探索する。一方、脂肪細胞分化を抑制すると予想されたRhoGEFについて、過剰発現によって骨分化が誘導されるかを検証する。過剰発現によって骨分化を誘導するRhoGEFが見出された場合、同様にBioID法を用いたプロテオーム解析を行って上流、下流で働く因子を探索する。
2. 基質硬度の感知、応答機構の解析：これまでに見出した脂肪細胞分化に関与するRhoGEFについて、基質の硬さに対する間葉系幹細胞の応答への関与を解析する。そのため、アクリルアミドゲルを用いた基質の硬さの操作と分化誘導培地を組み合わせた条件で脂肪細胞分化の効率を測定し、基質の硬さに依存した脂肪細胞への分化を検出できる方法を検討する。同時に、間葉系幹細胞の基質の硬さ依存的なアクチン骨格の構築パターンと細胞が硬い基質の方へ移動する走硬性（Durotaxis）に対する各々RhoGEFの機能を検証する。さらに、前項のプロテオーム解析によって見出された蛋白質について機械刺激のセンサー蛋白質である可能性を検証する。
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