2022 Fiscal Year Annual Research Report
臓器の左右極性を決定するゲノムネットワークに関する研究
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21H02488
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松野 健治 大阪大学, 大学院理学研究科, 教授 (60318227)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 発生 / 左右非対称性 / ゲノム / エンハンサー / RNAseq |
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| Outline of Annual Research Achievements |
からだの左右非対称性は動物発生の必須要素であるため、その機構の解明は発生学の重要課題である。研究代表者は、ショウジョウバエを無脊椎動物のモデル系として用い、左右非対称性形成に必要な遺伝子を網羅的に探索した。この研究において、narigoma（nag）と命名したエンハンサー／サプレッサーが、前半部消化管の左右極性の決定に不可欠であることがわかった。そこで、nagエンハンサー／サプレッサーを中心とするゲノムネットワークを解析し、前半部消化管の左右極性決定におけるその役割を明らかにすることを目的として、令和4年度に以下の実験を実施して成果を得た。
(1) nagエンハンサーの活性の解析
nagがエンハンサーであるとすれば、その転写促進活性はレポーター遺伝子を用いて検出できるはずである。そこで、基本的プロモーターとGFPレポーター遺伝子の上流に、遺伝学的にnagエンハンサーを含むことがわかっている3.5kbpのゲノム断片を挿入したコンストラクト（nagレポーター遺伝子）を作出して、遺伝子導入した。ショウジョウバエ胚においてnagレポーター遺伝子発現を調べたところ、nagは、前腸で特異的に活性化されるエンハンサーであることが示唆された。
(2) nagエンハンサーの標的遺伝子の同定
nagエンハンサーによる転写調整を受ける標的遺伝子（群）は、前半部消化管の左右極性決定の実行部隊として機能していると予測している。令和３年度において、これらの標的遺伝子をmRNA-seq解析法を用いて探索し、nagホモ接合体において、野生型と比較して、発現量が二倍以上増減する遺伝子の同定に成功した。令和4年度では、このうち発現が1/2以下に減少した25遺伝子について、既存の欠失突然変異のホモ接合体胚において前半部消化管の左右非対称性の異常を調べたところ、左右非対称性異常を示すものを同定することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の開始時点では、nag領域については、protein codingとnon-coding 遺伝子を含めて、既知遺伝子が存在しないゲノム領域であることを除いて、その機能は全く不明であった。このため、nagがエンハンサーでると予測して研究を開始した。令和4年度で実施したレポーター遺伝子を用いた解析によって、nagが、前腸で特異的に活性化されるエンハンサーであることを明かにできた。さらに、nagエンハンサーによる転写制御を受けている遺伝子が、前半部消化管の左右極性決定の実行部隊として機能していると考え、RNAseq法を用いてその同定を試みた。令和3年度に実施したRNAseqで同定した、転写量がnag突然変異体で1/2以下に減少している遺伝子について、これらが前半部消化管の左右非対称性の形成に機能している可能性を検討した。令和4年度に実施した実験の結果、nagエンハンサーの発現制御下で、前半部消化管の左右非対称性形成に機能している可能性がある遺伝子の同定に成功した。
これらの成果によって、nagエンハンサーを中心とする遺伝子ネットワークが左右非対称形成においてはたしている機能を解明するための突破口を開くことができたと判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) CRISPR/Cas9法によるnag最小領域の同定
現在までに、nag領域を、3.5kbpのゲノム領域まで絞り込んでいる。しかし、nag領域の機能を解明するためには、nag突然変異とし挙動する最小のゲノム領域を特定することが有効である。これまでと同様にCRISPR/Cas9法を用いて、nagゲノム領域により短い欠失突然変異を導入する。得られた欠失突然変異が、消化管の左右非対称性の異常を示すかどうかを指標として、nag領域を含むゲノム領域を限局していく。
(2) nagエンハンサーに含まれるシス領域の同定
令和4年度にnagレポーター遺伝子を作出し、ショウジョウバエ胚においてその発現を調べたところ、前腸における特異的発現が検出された。令和5年度において、nagエンハンサーを含む3.5kbpのゲノム断片をさらに細分化し、これらの断片のエンハンサー活性を同様の方法を用いて調べることで、シス配列を含む領域を絞り込む。この結果が、実験(1)で限定したnag領域を含むゲノム領域と一致するかどうかを検討する。
(3) RNAseq法を用いて同定したnag領域の標的遺伝子の機能解析
RNAseq法を用いて同定した、nag領域による発現制御を受ける遺伝子の候補について、これらが消化管の左右非対称性形成で機能しているかどうかを調べる。発現が1/2以下に減少した25遺伝子について、既存の欠失突然変異体を用いて、ホモ接合体胚の前半部消化管の左右非対称性の異常を調べ調べる。陽性であった遺伝子については、ゲノム編集法を用いて単一遺伝子座の突然変異を誘発し、そのホモ接合体の前半部消化管の左右非対称性が異常を示すことを確認する。発現が2倍以上上昇した遺伝子については、UAS/Gal4システムを用いて強制発現を実施し、前半部消化管の左右非対称性の異常が誘発されるかどうか調べる。
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