2021 Fiscal Year Annual Research Report
Thylakoid Membrane Remodeling and Optimization of Photosynthetic Activity
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21H02508
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
坂本 亘 岡山大学, 資源植物科学研究所, 教授 (20222002)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | チラコイド膜 / 膜リモデリング / 葉緑体 / 光合成 / NTPase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、シアノバクテリアで構造が決定されたVIPP1のin vivoでの機能をシロイヌナズナVIPP1で検証するためのin vitroとin vivoの機能解析を行った。まずin vitro実験では、大腸菌で発現して精製したVIPP1-Hisタンパク質を用いたNTPase活性部位の解析と複合体構造の変化について、点突然変異を導入して検討した。シアノバクテリアでは、構造から明らかになったヌクレオチド結合部位に変異（E126Q/E179Q二重変異）を導入したところATPおよびGTPの加水分解活性が完全に失活していたが、シロイヌナズナに同じ変異を導入したところ、これらの加水分解活性が失活せず、むしろ野生型よりも高い活性を示すことが明らかになった。一方で、N末端側のαヘリックス内のアミノ酸、特に11番目のバリン残基にアミノ酸置換を加えたVIPP1タンパク質では活性が低下する変異が得られた。次にin vivoの実験では、シロイヌナズナvipp1ノックアウト変異(vipp1-ko)をVIPP1-GFPで相補する実験系を用いて、同様のアミノ酸変異を導入することとした。今年度は上述した変異を導入したVIPP1-GFP遺伝子を作成してvipp1-ko変異体ヘテロ個体を形質転換する実験が全て完了した。来年度以降、ホモ個体を選抜しin vitroでの結果を検証する。さらに、チラコイド膜内におけるリモデリング分子VIPP1, CURT1およびFZLの膜内局在を調べたところ、VIPP1はストロマチラコイドに主局在する一方、VIPP1とCURT1はグラナマージンに局在することが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
VIPP1-His融合タンパク質を用いたATP/GTP加水分解活性の解析は、想定した変異を導入して解析が順調に進んだが、シアノバクテリアで見出されたヌクレオチド結合部位に導入した変異がシロイヌナズナでは影響なく、活性を持つことがわかった。この結果は予想外で、シロイヌナズナVIPP1は異なる活性部位を持つことを示している。これまでも、シロイヌナズナVIPP1タンパク質のネガティブ染色による電顕観察ではリング状の構造が得られていないため、シアノバクテリアと植物では異なる性質を持つことが考えられる。今年度作成中の、vipp1変異体をVIPP1-GFPで相補する実験系でも同様の変異を作っているので、来年度以降これらの結果がIn vitro活性の結果と同様であるかを検討する。
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| Strategy for Future Research Activity |
シロイヌナズナVIPP1のNTPase活性がシアノバクテリアと異なる可能性が指摘されたので、今後、シロイヌナズナVIPP1を用いた構造解析を改めて検討する必要性が生じてきた。このため、来年度以降は、活性測定に加えて、精製VIPP1タンパク質のネガティブ染色電顕観察も試み、オリゴマー構造と活性の相関についても詳しく検討する必要がある。構造解析を進めるにあたり、VIPP1-GFPを葉緑体から精製することも今後検討し、大腸菌からの生成タンパク質だけでない構造解析についても、今後、基礎的知見を収集する。
VIPP1-GFPの相補実験系は海外研究協力者と進めており、コロナ禍の影響で若干遅れているが、来年度にはホモ個体の作成が完了する予定であり、今後、その解析を予定通り進める。
VIPP1および、CURT1, FZLのチラコイド膜局在が生化学的に明らかにできたので、来年度以降は、CURT1, FZLについてもGFP融合タンパク質を発現させる実験系を確立し、今後の機能解析にも用いる。
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