2021 Fiscal Year Annual Research Report
Multi-level analyses for exploring evolutionary origin of excitatory neurons
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21H02591
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
野村 真 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (10323007)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 大脳皮質 / 興奮性神経細胞 / 神経回路 / 脳梁 / 進化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類大脳皮質の興奮性神経細胞の進化起源を探るため、哺乳類と同じ羊膜類に属する爬虫類、鳥類の背側外套の神経細胞の細胞形態や神経軸索伸長パターンの解析を行った。まず、GFPを発現するプラスミドベクターを電気穿孔法によりニワトリ胚の終脳に導入したところ、(DVR) Dorsal ventricular ridge を起始核として対側の終脳に投射する神経軸索や、終脳外套下領域 (subpallium)から中脳腹側部を経由して脳幹へと投射する神経軸索の標識が確認された。特に前者は哺乳類の脳梁に類似した神経回路である可能性がある。免疫組織化学的解析により、これらの神経回路を構成する神経細胞は転写因子であるCtip2およびSatb2を選択的に発現していることが示唆された。また、GFPを発現するAAV (rAAV2-retro-CAG-GFP、rAAV2-retro-hSyn-EGFP)を用いてスッポンの成体の背側皮質ウイルスベクターを局所注入し、数週間後に単離した脳の連続スライス標本を作製し、標識された神経細胞の局在と細胞形態を共焦点レーザー顕微鏡によって解析した。その結果、少数の外套神経細胞の標識が確認されており、AAVが爬虫類の神経回路の解析に有効であることが示された。さらに、スライスゴルジ染色キットを用いてスッポン外套領域の神経細胞の形態を解析し、DVRを構成する神経細胞の多くが多極性の形態を維持していることを確認した。これらの神経細胞の発生・移動を制御する分子機構の解析の一環として、Notchシグナルの恒常的活性化ベクター(NICD)をマウス、ニワトリ、スッポンの大脳外套に強制発現した結果、こうした動物群の外套における多極性細胞移動はNotchシグナルの撹乱に対して堅牢性をもつことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
GFP発現AAVによる爬虫類脳の神経細胞標識を行ったところ、脳サイズが小さいため注入されたAAVの多くが脳室内に拡散し、局所的な標識による外套神経細胞の神経回路マッピングが当初の予定よりも進展しなかった。その後AAV溶液とグリセリンを混合することでウイルス溶液の年性を高めることによって、局所的標識が可能であることが明らかとなった。空間的遺伝子解析を含めた遺伝子発現解析については現在試料作製や条件検討中であり、神経回路網の包括的なマッピングと合わせて次年度に実施予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ニワトリ、スッポン胚を用いた外套領域の興奮性神経細胞の神経回路マッピングを継続して行う予定である。特にニワトリに関しては、初年度の解析により大まかな神経回路マッピングができあがっており、今後哺乳類大脳皮質の層特異的な神経細胞との形態的・分子的な比較を行う予定である。またスッポンに関しては胚入手が可能な夏季にAAVによる大規模なマッピング実験を行うことで、外套領域の神経細胞の包括的マッピングを遂行予定である。蛍光標識した脳サンプルは透明化を行い３次元的な神経回路の可視化を行う。RNAseqによる爬虫類、鳥類外套におけるまたCtip2、Satb2の下流制御遺伝子の包括的な探索を行う。さらに東京都医学総合研究所の丸山千秋博士と共同して空間的トランスクリプトーム解析を実施する予定である。
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Research Products
(6 results)
