2022 Fiscal Year Annual Research Report
Regulatory mechanisms of synaptic protein accumulation and maintenance during memory formation.
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21H02595
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
実吉 岳郎 京都大学, 医学研究科, 准教授 (00556201)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
細川 智永 名古屋大学, 理学研究科, 講師 (30602883)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | シナプス可塑性 / 液-液相分離 / CaMKII / LTP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
記憶の基盤であるシナプス可塑性の誘導・発現機構は詳細に検討されているが、刺激後にシナプス強度を維持する仕組みについてはほとんど明らかになっていない。本研究は、記憶の細胞レベルの現象と考えられる長期増強現象(LTP)に伴うシナプスタンパク質のダイナミクスを生物学的液-液相分離で説明することを目指している。In vitroでの実験の結果を神経細胞へと還元することで記憶形成に伴う分子のシナプス微小空間での動態を明らかにすることを目的とする。具体的には（１）CaMKIIは相分離により一過性のCa2+上昇を長期的な情報伝達の切り替えスイッチとして機能することを検証する、（２）CaMKIIは相分離によりシナプス内部構造制御を介し伝達効率を向上させることを実験的に証明する、（３）CaMKIIによる相分離を人為的に制御することでシナプス可塑性が誘導あるいは解除されるか検討する。
今年度は、CaMKIIとアクチン細胞骨格系制御分子の相分離について、最小構成タンパク質とリン酸化の関与の検討をした。構成要素にシナプスタンパク質が必要であること、特定分子のリン酸化が必須であることがわかった。また、CaMKIIの１２－１４量体形成と相分離形成に関して、TEVプロテアーゼよって多量体から単量体にできるCamKIIを作製し、細胞内でのグルタミン酸受容体との相分離による液滴形成に多量体が関わることを確かめた。相分離の光操作を試みたが、光活性化の波長と酵素活性プローブ検出の相性が悪く条件検討中である。一方で、化学遺伝学的なアプローチで薬物による局在制御はうまく実験系を構築できたので、これを生かしたシナプスでのシグナル人為制御による検証を予定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
記憶の基盤であるシナプス可塑性の誘導・発現機構は詳細に検討されているが、刺激後にシナプス強度を維持する仕組みについてはほとんど明らかになっていない。本研究は、記憶の細胞レベルの現象と考えられる長期増強現象(LTP)に伴うシナプスタンパク質のダイナミクスを生物学的液-液相分離で説明することを目指している。In vitroでの実験の結果を神経細胞へと還元することで記憶形成に伴う分子のシナプス微小空間での動態を明らかにすることを目的とする。具体的には（１）CaMKIIは相分離により一過性のCa2+上昇を長期的な情報伝達の切り替えスイッチとして機能することを検証する、（２）CaMKIIは相分離によりシナプス内部構造制御を介し伝達効率を向上させることを実験的に証明する、（３）CaMKIIによる相分離を人為的に制御することでシナプス可塑性が誘導あるいは解除されるか検討する。
（１）に関してはインビトロでの相分離への取り込みを確認できたこと、（２）に関しては、活性化をモニターするタンパク質の精製まで終了している。（３）に関しては、方針欄に記述するが、人為的制御するツールを開発できたため、残りの期間で検討していけると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Tiam1下流のキナーゼカスケードであるPAKならびにLIMK1がCaMKIIとシナプス局所でLLPSを起こすことで、Tiam1-Rac-PAK-LIMK1経路を長期に活性化させるかテストする。LIMK1の基質コフィリンに対する脱リン酸化酵素SSH1Lの相分離形成に与える影響を検討する。一連の研究の中で、SSH1LがGluN2B-CaMKII-LIMK1によって形成される相分離から排除されることを見出した。これは、コフィリンのリン酸化に関わるシグナル伝達経路の制御が相分離によって達成されることを示唆する。今後、LIMK1やCaMKIIの相分離による液滴のスパイン内局在がリン酸化型コフィリンとまた、脱リン酸化型コフィリンがSSH1Lと一致するか、超解像顕微鏡やライブイメージングによって解析していく。
ナノボディを利用しCaMKIIをシナプスに局在化させるとシナプスでのCaMKIIの活性化が見られた。これに関しては、恒常的にシナプスへ局在させるものと刺激誘導型とを比較することで活性化に至るメカニズムが明らかになると考えている。そこでナノボディを利用したドラッグ誘導製シナプス局在化プローブを開発したので、シナプス局在とCaMKII活性化や相分離の関わりを明らかにしていく予定である。
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[Journal Article] CaMKII binds both substrates and activators at the active site2022
Author(s)
Can Ozden,Roman Sloutsky,Tomohiro Mitsugi, Nicholas Santos, Emily Agnello, Christl Gaubitz, Joshua Foster, Emily Lapinskas, Edward A. Esposito, Takeo Saneyoshi, Brian A. Kelch, Scott C. Garman, Yasunori Hayashi, and Margaret M. Stratton
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Journal Title
Cell reports
Volume: 40(2)
Pages: 111064
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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