2021 Fiscal Year Annual Research Report
希少微生物株のゲノムマイニングによる天然医薬品資源の探索
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21H02635
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
脇本 敏幸 北海道大学, 薬学研究院, 教授 (70363900)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 生合成遺伝子 / ゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では従来の天然物探索事例の少ない微生物株についてゲノム情報を取得し、ゲノム情報を起点とした新規天然物の探索を実施する。特に放線菌以外の菌株、中でも物質生産に秀でたグラム陰性菌を見出し、重点的に探索を進める。原位置培養方法を駆使して、未培養微生物株を収集するとともに、海綿動物や植物に共生する微生物株を重点的に探索標的とする。環境中より収集した菌株は16S rRNA配列によって系統解析し、放線菌以外で有望な微生物株を選別する。それらのゲノム解析を実施し、二次代謝物の生合成遺伝子を解析する。塩基配列と天然物の構造情報は現時点で完全には一致していないが、多くの代謝経路について経路を担う酵素や責任遺伝子が明らかになってきている。天然物の設計図である生合成遺伝子クラスターがゲノム上になければ、二次代謝産物が生産されることはないことを考えると、生合成遺伝子クラスターの有無は極めて重要な新規天然物探索の指標となる。本研究では新規微生物培養方法や次世代シークエンサーを駆使し、最先端の新規微生物二次代謝産物の探索を展開する。生合成遺伝子クラスターを起点とすることで様々なアドバンテージがある。第１に休眠遺伝子である場合はトランスポゾン変異などを導入して活性化を施すことができる。第２にひとたび新規天然物が得られれば、生合成遺伝子クラスターが紐づいてくるために、生合成経路の解析へ容易に展開できる。新規の二次代謝酵素が見出されれば生体触媒としての応用展開が期待できる。第３に生合成遺伝子クラスターには化合物の生合成経路のみならず、自己耐性機構が含まれている場合があるため、自己耐性機構から該当化合物の作用機序を明らかにすることができる。このように本研究では次世代型の新規天然物探索手法を最大限活用し、これまでにない包括的な探索研究を実施し、新規抗生物質や細胞毒性物質の発見を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
近年、膨大な未開拓生物資源として未培養微生物の存在が明らかにされている。特に土壌中には放線菌よりも優占種として存在する微生物群が見出されている。通常のシャーレを用いた培養によって単離することが難しい難培養微生物群の中にも二次代謝産物の生合成遺伝子クラスターを数多く有する種が報告されている。特にAcidobacteria門とVerrucomicrobia門において多様な遺伝子クラスターが見出されており、それらは既知の生合成遺伝子とは異なるユニークな配列であることがわかっている。しかしながら、菌株自体の単離事例がわずかであるため、二次代謝産物の探索事例もほとんど報告例がない。我々は原位置培養方法による環境微生物の単離を試みており、1,000株以上を取得した。さらに、得られた環境微生物株は16S rRNA配列によって系統解析し、特に放線菌以外でかつ過去の研究例が少ない微生物株を重点的に選別した。選別して得られた菌株についてOxford Nanopore sequencerを用いたドラフトゲノムシークエンス解析を実施した。ドラフトゲノム情報をもとにantiSMASHなどの解析ソフトを用いてNRPSやPKSなどの生合成遺伝子クラスターの検索を行った。遺伝子クラスターを豊富に含む菌株を選別し、培養して抽出物を作成、その代謝物プロファイルをLC-MSで分析するとともに、抗菌活性試験、細胞毒性試験を実施し、生物活性とLC-MSプロファイルの双方を指標に新規天然物の探索を進めている。その結果、北海道大学キャンパス土壌より分離したVariovorax属の菌株より複数のペプチド関連化合物を単離、構造決定した。これらの新規化合物は抗菌活性を示すシデロフォアであることが明らかになった。ドラフトゲノム解析から生合成遺伝子クラスターの候補も見出した。現在、詳細な生合成経路の検討を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで採集したバクテリアについて16S rRNA配列による分類を行い、順次ライブラリー化を進めている。Acidobacteria門などの興味深い菌株についてはドラフトゲノム解析を進めている。得られたゲノム情報から興味深い生合成遺伝子クラスターを有する菌株について重点的に代謝物分析を行う。すでに複数の探索候補株が得られており、それらの解析を引き続き進める。さらに生合成遺伝子クラスターがゲノム中に見出されても、実際に発現していない可能性があるため、培養条件を種々変更して代謝物プロファイルを確認する。また、菌株によっては倍加時間が遅く、培養が困難な菌株も見出されている。これらの菌株についてはゲノム情報をもとに、生合成遺伝子の異種発現、生産を試みる。
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