2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of bioactive compounds by activation of cryptic genes based on invasive evolution of pathogenic microorganisms
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21H02639
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
荒井 緑 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (40373261)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齋藤 駿 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 助教 (20846117)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 天然物 / 休眠遺伝子 / 共培養 / マクロファージ / 免疫抑制作用 / 進化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
放線菌や真菌は，多くの有用な化合物を提供してきた．しかしながらその遺伝子は２割程度しか働いておらず，新たな新規天然物を生産するであろう生合成遺伝子が眠ったままの休眠遺伝子であることがわかっている．我々は近年，病原放線菌と動物細胞の共培養法を開発し，休眠遺伝子活性化に成功している．この新規手法は，病原微生物が動物に感染する際の状況を再現し，疑似感染状態を模倣したもので，国内外でも初めての例であり独創的で新規性が高い．本研究では，本共培養法を病原真菌にも応用し，新たな共培養特異的化合物を見いだし，その生産機構に迫ることを目的とする．
千葉大学真菌医学研究センターが保有する臨床検体から分離された病原真菌と免疫細胞（マウスマクロファージ様細胞）を様々な条件下共培養を行った．細胞のみの培養，菌のみの培養および，共培養の際の化合物生産をHPLCで比較し，共培養特異的化合物を見いだした．
病原放線菌Nocardia tenerifensisとマウスマクロファージの共培養により生産されるnocarjamideの生産機構の解明に向け種々検討し，N. tenerifensisは，マクロファージの出す比較的大きいタンパク質に反応している可能性があると推定した．
病原真菌Aspergillus属とマウスマクロファージ様細胞の共培養を行い，共培養特異的に産生される化合物を単離・構造決定した．また，RNA-seq.により，fumarylalanineの生合成クラスターSidEが共培養特異的に発現が上昇することを見いだした．Aspergillus属とマウスマクロファージ様細胞との共培養で，fumarylalanineの生合成が上昇し，化合物は，fumarylalanineを用いて生合成されたと推測した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
病原放線菌Nocardia tenerifensisとマウスマクロファージの共培養により生産されるnocarjamideの生産機構の解明に一歩前進し，N. tenerifensisは，マクロファージの出す比較的大きいタンパク質に反応している可能性があると推定した．また，病原真菌Aspergillus属とマウスマクロファージ様細胞の共培養を行い，共培養特異的に産生される化合物を単離・構造決定し，RNA-seq.により，fumarylalanineの生合成クラスターSidEが共培養特異的に発現が上昇することを見いだした．共培養特異的化合物はfumarylalanineを用いて生合成されたと推測することができている．
また，その他のAspergillus属において，動物細胞との共培養も検討しており，共培養特異的化合物を２種，単離・構造決定に進んでいる．
また，その他の病原微生物と動物細胞との共培養も検討しており，共培養特異的化合物を２種得ており，構造解析中である．
このように，他の共培養系でも共培養特異的化合物が得られているため，本研究は順調に進んでいる．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，現在，共培養特異的化合物が得られている，Aspergillus属，病原微生物の単離化合物の詳細な構造解析を行い，さらに，RNA-seqを用いて動物細胞との共培養で発現が上昇している遺伝子から生合成遺伝子を特定していく．さらに，その生合成遺伝子をノックアウトした際に化合物が産生されなくなるかも検証する．また，動物細胞との共培養で，どうして休眠遺伝子が活性化されるのかのメカニズム解析のため，微生物と細胞の接触が必要なのか，細胞の培養液のみの添加で微生物の休眠遺伝子が活性化されるのか，などを検討していく．
また，今年度は，さらに異なるカテゴリーの微生物の使用も計画しており，本共培養系の応用範囲を検証していく．
また，合成的なアプローチも計画しており，単離された共培養特異的化合物を有機合成的に供給し，その生物活性を検討していく．生物活性は，免疫抑制活性や，神経幹細胞の分化促進活性，がん細胞への毒性，がん細胞の遊走阻害活性などである．また，重要なシグナル伝達である，Wnt, Hedgehog, Notchシグナルの細胞アッセイ系も有しており，それらへの影響も検討する．
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