2022 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
21H02670
|
|---|
| Research Institution | Mie University |
|---|
Principal Investigator |
田中 利男 三重大学, 医学系研究科, 産学官連携講座大学教員(特定教授) (00135443)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山田 佳代子 三重大学, 医学系研究科, 技術補佐員 (90866948)
山本 恭子 三重大学, 医学系研究科, 技術補佐員 (90892480) [Withdrawn]
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | ハイスループットスクリーニングシステム / 心毒性防御遺伝子 / 心毒性機構解析 / がん分子標的薬 / ゼブラフィッシュ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、がん分子標的薬による心毒性機構の解明及び心毒性防御遺伝子の発見により臨床における心毒性の予防や制御の実現を目指す事を目的とする。
そのため、独自の高感度高精度ハイスループットスクリーニングシステムを構築することにより、爆発的に増加しているがん分子標的薬の心毒性をリアルタイムに発見することを可能にする。さらに、新たに心毒性が見出されたがん分子標的薬の定量的心機能障害の特徴を明らかにする。またその心毒性メカニズムを心筋トランスクリープトミクスにより解析するだけではなく、心毒性制御を可能にする各がん分子標的薬の新規心毒性防御遺伝子を探索し、その作用機序を解明する。
具体的には、以下の３層の新しいOncocardiology研究法を構築する。
１）高感度ハイスループットin vivoフェノタイプスクリーニングシステム、２）定量的心機能イメージングシステム。３）心毒性が新しく見出されたがん分子標的薬については、心毒性発現濃度におけるトランスクリプトーム解析により、異常発現上昇遺伝子群と異常発現低下遺伝子群のネットワーク解析などから、心毒性防御遺伝子を解明する。
すなわち本研究では、新しいin vivoハイスループットスクリーニングシステムを構築し、大規模ながん分子標的薬スクリーニングを実施する。
この全自動高感度ハイスループットスクリーニングシステムを構築するため２種類の心筋に選択的蛍光タンパク質が発現する透明なゼブラフィッシュを創製する。心筋に限局したGFP（第１５染色体）が発現する透明なゼブラフィッシュMieKomachi009:MK009と、赤色蛍光蛋白質(mRFP)を接続したレポーター遺伝子を内在し心臓選択的にmRFPが発現するTg(myl7:mRFP):Tg017を、交配により透明化(nacre)し、MK069を創製することにより毒性機構スクリーニングを実現する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
全自動高感度高精度心毒性スクリーニングシステムを構築し、臨床心毒性との相関性を解析するために創製した３種類の心筋に選択的蛍光タンパク質が発現する透明なゼブラフィッシュにより、がん分子標的薬をスクリーニングした。
緑色蛍光蛋白質(GFP) が第１５染色体に挿入したゼブラフィッシュSAG4Aが、心筋選択的に発現するゼブラフィッシュと透明(nacre)ラインと交配し、MieKomachi009:MK009を創製したが、これにより進行した肝細胞がんなどの治療に使用されているsorafenibとCMLの治療に使用されるnilotinibの心蛍光面積や心蛍光強度に対する濃度依存性変化を解析したところ、全く異なる作用を見出した。すなわちsorafenibは、蛍光面積減少かつ蛍光強度増加であり、nilotinibは、蛍光面積増加かつ蛍光強度現象であった。
さらに、心臓選択的にmRFPが発現するTg(myl7:mRFP):Tg017を、交配により透明化(nacre)し、MK069を創製し、さらにこれら2種類を交配により、心筋選択的にGFP(緑色)とRFP(赤色)がゲノム上の異なる位置から発現する透明MK070を創製し、ハイスループットスクリーニングを実施した。
さらに、各がん分子標的薬による心筋トランスクリプトーム解析により、まず各がん分子標的薬のしん毒性機構解明を試みた。その結果、明らかに心蛍光面積や心蛍光強度に対する濃度依存性変化が全く異なるsorafenibとnilotinibによる心トランスクリプトーム変化の明確な差異が認められた。すなわちsorafenib選択的に発現上昇する２１４遺伝子、発現低下する７遺伝子、nilotinib選択的に発現上昇する８３遺伝子、発現低下する２９２遺伝子を見出したので、これらから心毒性遺伝子候補と心毒性防御遺伝子候補を、in silico解析した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本研究の第２層Oncocardiology研究である定量的心機能解析研究法は、臨床心毒性における心エコーMモード解析と相関関係解析が可能であり、臨床外挿性についての検討が実現する。すなわち、本研究により見出された新しい心毒性がん分子標的薬nilotinibの臨床心毒性病態との類似性を、以下の測定項目などにより相関解析する。
独自の心機能測定項目である１）拡張末期径(VDd)、２）拡張末期容積(EDV)、３）収縮末期径(VDs)などの測定項目と臨床心エコーMモード測定項目の相関を解析し、前臨床と臨床の心毒性における類似性を検討する。本研究第３層Oncocardiology研究法により、がん分子標的薬nilotinibの心毒性防御遺伝子を発見し、心毒性の予防や治療への臨床応用研究を展開する。
１）がん分子標的薬nilotinibの臨床心毒性出現濃度や臨床心毒性病態プロフィールとの相関を解析し、臨床心毒性への外挿性を確立する。
２）がん分子標的薬nilotinibを作用させ、心筋トランスクリプトーム解析を実施し、がん分子標的薬nilotinibのできるだけ低濃度かつ早期に異常遺伝子発現増加する遺伝子群と異常遺伝子発現低下する遺伝子群を抽出する。
３）がん分子標的薬nilotinib心毒性関連遺伝子群から、新規心毒性防御遺伝子候補リストを作成し、nilotinibにより遺伝子発現が上昇する場合は、モルフォリノアンチセンスオリゴによるノックダウンか、CRISPR-Cas9によるノックアウトにより、nilotinibの心毒性に対する作用を指標としたスクリーニングを実施する。
４）このスクリーニングにより、最も明白ながん分子標的薬nilotinibの心毒性防御作用を示す遺伝子を、nilotinibの新規心毒性防御遺伝子として、その作用機構を解明し、臨床応用の可能性を検討する。
|
