2021 Fiscal Year Annual Research Report
細胞膜脂質オーガナイザーとしてのPI-4キナーゼ複合体の機能とその破綻
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21H02694
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
中津 史 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (50360607)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | イノシトールリン脂質 / ホスファチジルセリン / コレステロール |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度はまずphosphatidylinositol 4-kinase type III alpha (PI4K3a)複合体による細胞膜脂質制御機構について解析を行った。細胞膜イノシトールリン脂質に依存して細胞膜の脂質輸送を制御する分子についてのスクリーニングを行い、その候補分子群を得た。そこで、これらの候補分子について、GFP融合タンパク質として培養細胞に一過性に発現させてその局在を解析したところ、小胞体と細胞膜間のメンブレンコンタクトに局在することが判明した。その局在の分子メカニズムを探るため、種々の変異体を作成しその局在を検討することで、小胞体―細胞膜コンタクトへの局在に必須に領域の絞り込みを行った。また、阻害剤などを用いて細胞膜脂質の合成を阻害し、局在変化を解析した。さらに、ラパマイシンを用いたFKBP-FRBヘテロ２量体化システムを利用して、特定の細胞膜脂質を急速に分解した時の局在についても解析を行った。これらの解析から、小胞体―細胞膜コンタクトに局在する候補分子群の局在化メカニズムに関する知見を得た。また、候補分子群が輸送する脂質の同定に着手した。脂質を結合することが予想されるドメインを動物細胞に発現させ、組換えタンパク質の精製を試みた。現在、スケールを増やして目的のタンパク質の大量精製を行っているところである。さらに、これら候補分子群による脂質輸送についての解析にも着手した。まず前述と同様に脂質輸送を担うと予想されるドメインの組換えタンパク質を大腸菌から精製した。ゲルろ過カラムを用いて単量体を精製可能であることが確認された。現在、スケールを増やして精製を試みている。これらの組換えタンパク質精製が完了したのち、輸送する脂質種の同定、およびin vitroでの脂質輸送アッセイを行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞膜の脂質を制御する候補分子群を同定し、その局在やその分子メカニズムに関する知見が得られたこと、またそれらの脂質輸送解析のための生化学的実験についても成果が得られていることから、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでほぼ計画通りに進行していることから、今後も当初の計画に沿って進める。脂質輸送タンパク質の解析として、生化学的解析やイメージング解析を進めるとともに、培養細胞を用いたスクリーニング系の構築なども進めていく。
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