2021 Fiscal Year Annual Research Report
バイオイメージングで解き明かす人獣共通感染症細菌の宿主依存的病原性発現機構
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21H02727
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
中村 修一 東北大学, 工学研究科, 准教授 (90580308)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小泉 信夫 国立感染症研究所, 細菌第一部, 主任研究官 (10333361)
加藤 貴之 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (20423155)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 細菌 / 人獣共通感染症 / イメージング / レプトスピラ症 / 運動性 / 細菌べん毛 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，細菌の病原性規定因子ならびに宿主選好性のメカニズムを解明することを目的として，細菌感染した動物の特定組織細胞表面における病原体の動態を定量的に解析し．症状の重症度や保菌状態との関連を調べる．病原性種が250以上の血清型に分類され，多様な哺乳動物に感染する人獣共通感染症病原体であるレプトスピラ属細菌の運動性と病原性ならびに宿主選好性の関係に注目する．令和３年度から繰り越した内容は，当初の予定よりも遅れて令和４年度に導入した組織切片化装置を使用して，細菌感染させた実験動物から摘出した腎臓細胞の切片試料の作製条件を検討すること，光学イメージングと人工知能を用いた画像解析を用いて臓器切片表面でのレプトスピラ細菌の動態を解析することであった．動物細胞上での細菌運動解析を行うには，これまで，細菌の蛍光ラベリングが必須であった．しかし，本研究で新たに開発した人工知能（機械学習）を用いた画像解析技術の導入により，細菌の蛍光ラベルを必要としない，いわゆる「ラベルフリー計測」が可能となった．この技術によって，培養細胞上で行うin vitro感染実験にいかなる菌株も利用でき，また摘出臓器切片上での感染細菌の動態解析も可能になることが期待される．分担研究者機関に設置した装置を用いて切片化条件の検討を行い，厚さ約60マイクロメートルの試料作製に成功した．感染動物の腎臓細胞に病原体は確認されなかったが，顕微鏡下で切片に菌液を滴下して観察するなど予備実験を行い，画像解析までをデモンストレーションすることができた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
in vitro感染実験に蛍光標識していない細菌を利用するできる「ラベルフリー細菌運動追跡法」を開発した．本手法は，ベイズ推定を利用した機械学習ベースの背景差分法を中心に，複数の画像解析を組み合わせたもので，（１）ビデオ顕微鏡で取得したデジタル動画の入力，（２）前景（細菌）と背景（培養細胞）の自動分離と背景差分，（３）二値化画像の膨張・収縮処理，（４）細胞形態の特徴に基づく粒子の選別，（５）細胞重心の決定と時系列追跡，といった工程で構成される．Pythonで構築されたこれらのプログラムを用いることで，任意の閾値で二値化する従来の画像解析では背景と前景の分離が難しい動画でも，動物細胞上にある細菌の運動追跡を行うことができるようになった．また，手法は遊泳細菌の解析にも有用である．
細菌感染させた実験動物からの摘出腎臓をスライスし，顕微鏡下で臓器切片上の細菌を観察する実験では，始めに切片化条件の検討を行った．顕微鏡観察を行うには，厚さ50マイクロメートル前後で切片化する必要がある．実験に使用したリニアスライサーの限界は60マイクロメートルであるため，60マイクロメートルでの切片化を安定して行える条件を検討した．臓器の冷却を行うことで，60マイクロメートルの切片化には成功し，顕微鏡下で腎臓細胞を鮮明に観察することができた．しかし，レプトスピラ細菌は切片上に観察されなかった．腎臓に定着したレプトスピラ菌数が少ない可能性もあったため，レプトスピラ細菌を臓器切片に滴下した後に観察する予備実験も行ったが，臓器切片のシグナルがやや強く，細菌を観察するには至らなかった．
このように，今後解決すべき課題があるものの，総合的にはおおむね順調に進展していると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
ラベルフリー運動解析法の構築は，細菌への蛍光遺伝子導入を必要としないため，使用菌株を選ばない．このことは，臨床分離株や，偶発的に得られた変異株も自由に実験に使えることを意味する．宿主選好性のメカニズム解明を目指す本研究では，可能な限り，培養細胞の種類（宿主の種類）と菌株の組合せ数を増やすことが重要である．宿主種は，感染後の症状が比較的よく分かっている種や，細胞培養が可能な種に限られる．現在は主に，代表的な維持感染宿主であるラットの腎臓細胞（NRK）と，いくつかのレプトスピラ血清型の感染によって重症化するイヌの腎臓細胞（MDCK）を利用している．これまでの研究ではレプトスピラに蛍光遺伝子を導入する必要があったため，遺伝子操作技術が十分に確立されていない本菌では使用菌株数を十分に得ることができなかった．しかし．ラベルフリー実験の確立によって，いかなるレプトスピラ株も使えるようになった．今後は，これまでに哺乳動物から分離された株を使用したin vitro感染実験を行うとともに，分離動物の症状（不顕性，軽症，重症など）とあわせて，宿主―菌株の組み合わせ依存的な病原性機構の解明を目指したい．
分担研究者・小泉が確立したトランスポゾンランダム変異挿入法により，これまでにいくつかの興味深い運動変異体が得られている．これらは，軟寒天培地中でコロニーサイズが野生型株に比べて小さいという表現型で得られたものである．一般的に，コロニーサイズは運動性と関連するが，個々の変異株の運動特性は調べれられていない．今後は，得られたトランスポゾン挿入変異体の基本的な運動特性（液体培地中での遊泳運動解析など）をはじめに行い，その結果を踏まえて，in vitro感染実験への使用を検討したい．
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