Promotion of emerging and re-emerging virus research using high-speed reverse genetics

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21H02736
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 福原 崇介 北海道大学, 医学研究院, 教授 (70598739)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小野 慎子 大阪大学, 感染症総合教育研究拠点, 特任准教授(常勤) (30626437) ; 津田 祥美 長崎大学, 高度感染症研究センター, 准教授 (70447051)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 高速リバースジェネティクス / レポーター / マウスモデル / SARS-CoV-2

Outline of Annual Research Achievements

SARS-CoV-2のマウスモデルの確立においては、マウス馴化に必須と報告されている変異を複数持つMA-10株をCPERを用いたリバースジェネティクスで作出した。このMA-10はBalb/cマウスで効率的に感染することが報告されていたが、我々の検討でも同様に効率的な増殖が認められた。しかし、他の系統のマウスでの増殖性は低かったが、高力価での感染によって、一定レベルの増殖性と病原性が認められることが明らかになった。
また、Akalucを搭載した組換えSARS-CoV-2-AkalucはAkaluc遺伝子のGC含量をSARS-CoV-2に合わせて低下させることによって、うまく搭載させることができた。2022年度は、in vitroでの性状解析を行った。ノーザンブロッティングで、正しいRNAサイズの組換えウイルスが作製されていた。また、in vitroでの増殖性を評価したところ、野生型ウイルスと同等の増殖性が確認された。また、5回以上の継代を行っても、Akaluc遺伝子は維持されており、ルシフェラーゼ活性も維持されていた。今後は、in vivoでのImagingにおける有効性を明らかにする。
さらに、CPERを駆使した高速リバースジェネティクスによって、様々な変異株のスパイク遺伝子を持つキメラウイルスを作製して、その組換えウイルスの性状解析を行った。変異株が出現するたびに、迅速に組換えウイルスを作製することによって、変異株の病原性や免疫逃避などをリアルタイムに解析することができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

予定通り、研究が推進できており、業績も発表できているため、順調な進展と判断した。

Strategy for Future Research Activity

SARS-CoV-2-Akalucを感染させて、Imagingを行なった肺組織の病理組織解析を行い、Imagingで感染が検出された部位で炎症の誘導やウイルス抗原が検出できることを免疫染色など病理解析の手法を用いて検証する。ワクチンや抗ウイルス薬のin vivoでの有効性の評価ではこれまでの予備実験の中で、ハムスターへのmRNAワクチンの投与によってSARS-CoV-2の感染予防効果を認めた。SARS-CoV-2-Akalucを用いて生体における抗ウイルス効果を検証する。一方、マウス感染モデルの構築においては、これまでの検討で、マウスに馴化させるための変異を搭載したMA10株を組換えウイルスで作製して、マウスでの増殖性と病原性を確認した。本年は、後遺症を評価可能なモデルの確立を試みる。マウスへの以下の3種類の感染系を用いてより有用な動物モデルの確立を目指す。① 馴化ウイルスであるMA10のマウスへの経静脈感染：分担者の田村が感染することが可能な変異と流行変異株のスパイクを持つマウス馴化ウイルスを作製し、ウイルスの経静脈接種は実験系を樹立した村上が担当する。② 馴化ウイルスの髄腔内感染：髄腔内接種は経験がある福原が担当する。③ ヒトACE2トランスジェニックマウスへの感染：①または②でのウイルスの増殖性が低い場合は全身の組織での高い増殖性が確認されている本モデルを用いる。様々な組織での増殖性はリアルタイムPCRでのウイルス量の評価だけでなく、Akalucを搭載したレポーターウイルスを用いたImagingや病理標本における抗原の検出を駆使し、ウイルスの時空間的挙動を評価する。また、津田はCPER技術を駆使して、引き続きSFTSVのリバースジェネティクスの確立を試みる。

Research Products

• [Journal Article] Attenuated fusogenicity and pathogenicity of SARS-CoV-2 Omicron variant. (2022)
  • Author(s): Suzuki R, 他多数、Sawa H, Ikeda T, Irie T, Matsuno K, Tanaka S, Fukuhara T (Corresponding author), Sato K.
  • Journal Title: Nature Volume: 603(7902) Pages: 700-705
  • DOI: 10.1038/s41586-022-04462-1.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Virological Characteristics of SARS-CoV-2 BA.2 variant. (2022)
  • Author(s): Yamasoba D, 他多数、Sawa H, Saito A, Irie T, Tanaka S, Matsuno K, Fukuhara T (Corresponding author), Ikeda T, Sato K.
  • Journal Title: Cell Volume: 185(12) Pages: 2103-2115
  • DOI: 10.1016/j.cell.2022.04.035.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Antiviral activity of ciclesonide acetal derivatives blocking SARS-CoV-2 RNA replication. (2022)
  • Author(s): Tsuji G, Nakajima S, Watashi K, Torii S, Suzuki R, Fukuhara T, Ohaka N, Inoue T, Demizu Y.
  • Journal Title: J Pharmacol Sci Volume: 149(3) Pages: 81-84
  • DOI: 10.1016/j.jphs.2022.04.001.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Secretory glycoprotein NS1 plays a crucial role in the particle formation of flaviviruses. (2022)
  • Author(s): Tamura T, Torii S, Kajiwara K, Anzai I, Fujioka Y, Noda K, Taguwa S, Morioka Y, Suzuki R, Fauzyah Y, Ono C, Ohba Y, Okada M, Fukuhara T (Corresponding Author), Matsuura Y.
  • Journal Title: PLoS Pathog Volume: 18(6) Pages: e1010593
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1010593.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Impact of JMJD6 on intrahepatic cholangiocarcinoma. (2022)
  • Author(s): Kosai-Fujimoto Y, Itoh S, Yugawa K, Fukuhara T, Okuzaki D, Toshima T, Harada N, Oda Y, Yoshizumi T, Mori M.
  • Journal Title: Mol Clin Oncol Volume: 17(2) Pages: 131
  • DOI: 10.3892/mco.2022.2564.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] SARS-CoV-2 Omicron detection by antigen tests using saliva. (2022)
  • Author(s): Murakami K, Iwasaki S, Oguri S, Tanaka K, Suzuki R, Hayasaka K, Fujisawa S, Watanabe C, Konno S, Yokota I, Fukuhara T, Murakami M, Teshima T.
  • Journal Title: J Clin Virol Plus Volume: 2(4) Pages: 100109
  • DOI: 10.1016/j.jcvp.2022.100109.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Virological characteristics of the SARS-CoV-2 Omicron BA.2 subvariants, including BA.4 and BA.5. (2022)
  • Author(s): Kimura I, 他多数、Hashiguchi T, Ikeda T, Saito A, Fukuhara T (Corresponding Author), Tanaka S, Matsuno K, Sato K.
  • Journal Title: Cell Volume: 185(21) Pages: 3992-4007
  • DOI: 10.1016/j.cell.2022.09.018.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Smoking Enhances the Expression of Angiotensin-Converting Enzyme 2 Involved in the Efficiency of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infection. (2022)
  • Author(s): Suzuki R, Ono Y, Noshita K, Kim KS, Ito H, Morioka Y, Tamura T, Okuzaki D, Tagawa T, Takenaka T, Yoshizumi T, Shimamura T, Iwami S, Fukuhara T.
  • Journal Title: Microbiol Immunol Volume: 67(1) Pages: 22-31
  • DOI: 10.1111/1348-0421.13034.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Virological characteristics of the SARS-CoV-2 Omicron BA.2.75 variant. (2022)
  • Author(s): Saito A, 他多数、Shirakawa K, Sawa H, Irie T, Hashiguchi T, Takayama K, Matsuno K, Tanaka S, Ikeda T, Fukuhara T (Corresponding Author), Sato K.
  • Journal Title: Cell Host Microbe Volume: 3128(22) Pages: 1540-1555
  • DOI: 10.1016/j.chom.2022.10.003.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 高速リバースジェネティクスのIRES依存 +ssRNAウイルスへの応用 (2022)
  • Author(s): 田村友和
  • Organizer: 日本ウイルス学会北海道支部会第55回夏季シンポジウム
• [Presentation] IRES依存+ssRNAウイルスへのリバースジェネティクス法の高速化 (2022)
  • Author(s): 田村 友和、山本 紘嵩、荻野 紗帆、日尾野 隆大、鈴木 理滋、鈴木 紗織、 磯田 典和、迫田 義博、福原 崇介
  • Organizer: 第28回トガ・フラビ・ペスチウイルス研究会
• [Presentation] 数理モデルと分子動力学シュミレーションを用いたレムデシビル耐性SARS-CoV-2変異体の解析 (2022)
  • Author(s): 鈴木理滋
  • Organizer: 第69回 日本ウイルス学会学術集会
• [Presentation] Role of secretory glycoprotein NS1 in the particle formation of flaviviruses (2022)
  • Author(s): Tomokazu Tamura, Shiho Torii, Kentaro Kajiwara, Itsuki Anzai, Yoichiro Fujioka, Kisho Noda, Shuhei Taguwa, Yuhei Morioka, Rigel Suzuki, Yuzy Fauzyah, Chikako Ono, Yusuke Ohba, Masato Okada, Takasuke Fukuhara, Yoshiharu Matsuura
  • Organizer: 第69回日本ウイルス学会学術集会
• [Presentation] CPER法による高速リバースジェネティクスを駆使したSARS-CoV-2の応用研究 (2022)
  • Author(s): 福原崇介
  • Organizer: 北海道病理談話会
  • Invited
• [Presentation] Establishment of a simple high-speed reverse genetics system for SARS-CoV-2 and application research using recombinant viruses. (2022)
  • Author(s): 福原崇介
  • Organizer: IWHM6
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 高速リバースジェネティクスを用いたSARS-CoV-2の応用研究 (2022)
  • Author(s): 福原崇介
  • Organizer: 第28回トガ・フラビ・ペスチウイルス研究会
  • Invited