2021 Fiscal Year Annual Research Report

Molecular pathogenesis of brain malformations in de novo postzygotic mutations in the brain

Research Project

Project/Area Number	21H02883
Research Institution	Kyoto Prefectural University of Medicine
Principal Investigator	伊東恭子京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80243301)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	藤本崇宏京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (10446114) 伏木信次京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任教授 (80150572)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	胎児医学 / 体細胞モザイク / 脳形成異常 / 脳オルガノイド / 子宮内電気穿孔法 / 神経幹・前駆細胞
Outline of Annual Research Achievements	pmCherry-N1ベクターを骨格として、プロモーターをpCMVからpCAGに変更、HA-tag、かつ細胞膜移行シグナルCaaXを入れたベクターに、AKT1 E17K、PIK3CA E545Kを挿入し、変異遺伝子とWTのベクターを作製した（pCAG-AKT1-HAtag-P2A-mCherry, pCAG- AKT1-HAtag-P2A-mCherry-CaaX、pCAG-AKT1E17K-HAtag-P2A-mCherry, pCAG- AKT1 E17K -HAtag-P2A-mCherry-CaaX、pCAG-PIK3CA-HAtag-P2A-mCherry, pCAG- PIK3CA -HAtag-P2A-mCherry-CaaX、pCAG-PIK3CAE545K-HAtag-P2A-mCherry, pCAG- PIK3CAE545K -HAtag-P2A-mCherry-CaaX）。胎齢13.5日にin utero electroporationにより、上記プラスミドを胎仔脳脳室帯神経幹・前駆細胞に導入後、胎齢15.5日、16.5日、17.7日の胎仔脳を組織解析した。変異遺伝子（AKT1E17K）導入細胞は、PIK3-AKT-mTORシグナルが過活性化されており、幼弱な神経細胞はサブプレートから中間帯に結節状に残存し、皮質板への遊走が抑制されていた。これらの神経細胞では、皮質神経細胞の層マーカとなる複数の転写因子群の発現がかく乱されていた。今後、分化・遊走障害の分子メカニズムを明らかにしていく予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason COVID-19の感染拡大下ではあるが、十分な感染予防対策を講じて、研究はほぼ順調に進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	1. in vivo での動的解析 1-1) pCAG-gene-HAtag-P2A-mCherry、pCAG-gene-HAtag-P2A-mCherry-CaaXを用いて、変異遺伝子（AKT1 E17K、PIK3CA E545K）と野生型（AKT1、PIK3CA）のベクターを作製した。1-2) マウス胎仔脳への遺伝子導入と細胞挙動解析：作製した蛍光標識ベクターを、胎齢13.5日のマウス胎仔（C57BL/6系統）の側脳室脳室帯に子宮内電気穿孔法で導入し、モザイク脳を作製する。遺伝子導入1-3日後に胎仔脳を摘出し、組織切片（200μm）を作成しCO2細胞培養チャンバー内で組織培養を行い、共焦点レーザ顕微鏡下のタイムラプスで導入細胞の移動、突起伸長を24時間～48時間観察する。1-3) 空間的遺伝子発現解析：胎齢13.5日のマウス胎仔脳側脳室脳室帯に子宮内電気穿孔法でベクターを導入し、胎齢15.5日の胎仔脳を対象にVisiumを用いて空間的遺伝子発現解析を行なう（受託解析）。 2. in vitroでの解析 2-1) episomal型ベクター作製：ヒトNSPCsに安定発現させるベクター作製を行なう。目的遺伝子は、これまで同定されたヒト遺伝子異常：AKT1［c.49G>A p.(Glu17Lys)］、PIK3CA ［c.1633G>A p.(Glu545Lys)］とする。蛍光標識episomal型蛋白発現ベクター（pEBMulti-Puro）を用いる。2-2) c-Myc導入により不死化したヒト正常胎児由来神経幹・前駆細胞（以後NSPCs）に、2-1)のベクター導入を行ない、安定発現株を樹立する。遺伝子導入したNSPCs、遺伝子非導入（正常）NSPCsを至適な割合（0.2～0.4:1）で混合し、特殊微小環境下で14-28日間培養し、脳オルガノイドを形成し、組織学的に解析する。