2022 Fiscal Year Annual Research Report
フラビウイルス科の各ウイルスを厳密に区別できるモノクローナル抗体の開発
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21H02971
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| Research Institution | High Energy Accelerator Research Organization |
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Principal Investigator |
加藤 龍一 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 准教授 (50240833)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小澤 龍彦 富山大学, 学術研究部医学系, 准教授 (10432105)
正木 秀幸 近畿大学, 生物理工学部, 准教授 (90247982)
宮下 尚之 近畿大学, 生物理工学部, 准教授 (20452162)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | フラビウイルス / 中和抗体 / Ｘ線結晶構造解析 / ＭＤシミュレーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ウエストナイルウイルス（WNV）は、時に致死性の脳炎・髄膜炎を惹き起こすフラビウイルス科の蚊媒介性ヒト感染性ウイルスである。世界の広い地域に分布し我が国への感染拡大の危険性が指摘されているが、実用的な治療薬やワクチンは未だ無い。研究分担者らによって見出された WNV に働く中和抗体は、同じフラビウイルス科の日本脳炎ウイルス(JEV)とも交差反応を示すという興味深い性質を持つ。我々はその抗体と WNV のエンベロープタンパク質（Ｅタンパク質）との複合体の立体構造の決定に成功し、異なるウイルスを同時に認識する抗体の分子機構を明らかにした。その構造基盤を発展させ、(1) フラビウイルス科の各種ウイルスを同時に認識する抗体を開発し、異なるフラビウイルス感染症のどれにも効果のある抗体医薬開発につながる知見を得ること、(2) フラビウイルス科の中の特定のウイルスだけを認識する抗体を開発し、多重感染地域などでどのウイルスに感染しているかを判定できる診断薬の開発につながる知見を得ること、を研究の目的とし、フラビウイルス科の日本脳炎、黄熱病、ジカ熱の各ウイルス（JEV, YFV, ZIKV）のＥタンパク質とその中和抗体の認識機構を明らかにすべく、両者のタンパク質複合体の立体構造解析を目指し研究を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
JEV, YFV, ZIKVのＥタンパク質の発現コンストラクトの作成を行った。それらのうち、JEVとYFVについては、発現および精製法の確立に成功し大量精製を行い、Fab化抗体についてもその大量精製を行った。これらを用いて複合体形成について調べたところ、JEVのＥタンパク質とFab化抗体は強い親和性を示し安定な複合体を得ることができた。一方、YFVのEタンパク質とFab化抗体は弱い親和性を示すことがわかった。それぞれについて結晶化スクリーニングを行い、YFVのEタンパク質とFab化抗体については、針状結晶を得て現在結晶化条件の最適化を行っている。
各ウイルスと中和抗体の中和活性測定系の構築のため、それぞれのウイルスに対するプラーク減少法を用いた実験系の構築の準備を進めた。具体的には、JEV Beijing-1株・ZIKV PRVABC59株、およびVero細胞9013株を入手して培養を行い、中和活性測定に用いるためのストックを作製した。また、WNV RVPを用いた中和活性測定実験を行うための拡散防止措置の大臣確認が得られたため、それに必要なRprBHK2G2細胞株と、pCAGGS-WNV CおよびpCAGGA-WNV prM/Eの２種類のプラスミドを入手した。
我々が構造を決定したWNVのEタンパク質のdomain 3 (D3) とFab化抗体の相互作用が、他のウイルスで保存されている可能かを検討するため、WNVとFab化抗体の複合体、JEVとFab化抗体の複合体モデル作成とそれらの分子動力学（MD）シミュレーションを実施した。WNVとJEVで共通な相互作用、異なる相互作用のほか、結晶構造とは違う相互作用も見出され、Fab化抗体のWNV EとJEV Eに対する結合力の違いの原因である可能性とともに、結晶構造とは異なる溶液中での相互作用の可能性についても示唆することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、JEV, YFVとFab化抗体との複合体の結晶化実験を行い、それら複合体の立体構造解析を目指す。現在、WNV EとFab化抗体との複合体結晶を核としたミクロシーデングで結晶を得ることを見出しており、それら知見を活用して実験を進める。中和活性測定法については、その準備を引き続き進め、できるだけ早くに測定ができるようにする。MDシミュレーションについては、今までの結果についてさらにその詳細について調べ、また、YFV のEタンパク質とFabの複合体モデリングおよびそのMDシミュレーションを行う。
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