2021 Fiscal Year Annual Research Report
脂肪や血管組織老化に伴う機能変容における老化関連長鎖非コードRNAの基盤的研究
| Project/Area Number |
21H02974
|
|---|
| Research Institution | Chiba University |
|---|
Principal Investigator |
橋本 直子 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任助教 (10724875)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 知明 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (50447299)
OSHIMA JUNKO 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任教授 (80792275)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 細胞老化 / lncRNA / 転写因子p53 / 脂肪細胞 / 加齢性疾患 / 血管内皮 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
近年lncRNAの作用点として、microRNA(miRNA)スポンジとして機能することが明らかとされている。そこで、今年度は特にがんと老化の接点となるmiRNAに着目して、その作用分子メカニズムの研究を推進した結果、大きな進展が得られた。がん抑制型miRNAと報告のあるmiR874-3pに着目して、ヒト乳がん細胞株を用いて細胞内代謝に関連したがん抑制の分子メカニズムについて検討した。まず、乳がん細胞株MCF-7にmiR-874を発現させてRNA-Seqを行い、発現変動遺伝子群を網羅的に解析した。RNA-Seqではp53経路やMyc経路の亢進のほか、SREBF2やメバロン酸経路の複数の遺伝子（HMGCR、PMVK、MVD、FDPS）の発現低下がみられた。そこで、MCF-7にmiR-874を遺伝子導入して細胞周期や細胞死への影響を解析した。MCF-7にmiR-874を導入すると、p53野生型では著明な細胞死が誘導されたが、p53ノックアウトでは細胞死は軽度であり、p53・c-Mycダブルノックアウトでは細胞死誘導は認めなかった。またsingle cell RNAシーケンスでもmiR-874導入によりp53経路の活性化を伴うアポトーシス誘導を確認した。
次に、miR-874により著明に発現抑制されたホスホメバロン酸キナーゼ（PMVK）に着目し、レポーターアッセイを行ったところ、PMVKがmiR-874の標的遺伝子であることが明らかとなった。さらにPMVKをノックダウンするとp53依存的な細胞増殖抑制が認められ、この効果はGGPP添加により解除された。本研究により、乳がん細胞においてmiR-874がPMVKを標的としてメバロン酸経路を抑制すること、p53依存的な細胞死誘導を介してがん抑制的に作用することが明らかになった。これらの知見をまとめて、現在論文投稿中である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、老化関連p53-lncRNAの同定と機能解析、エピゲノム制御メカニズムとしてのp53-lncRNA高次複合体解析を組み合わせることで、内分泌臓器としての脂肪や血管において、老化に伴う機能変容におけるp53-lncRNAの役割とそのエピゲノム制御機構を明らかにすることである。今年度は特にがんと老化の接点となるmiRNAに着目して、その作用分子メカニズムの研究を推進した。lncRNAは高次転写複合体や転写因子間のネットワークのkey regulatorとなり、miR-874についても複数のlncRNAがmiR-874のスポンジとして相互作用することが報告されている。本研究により、乳がん細胞においてmiR-874がメバロン酸代謝経路を抑制し、p53依存的な細胞死誘導を介してがん抑制的に作用するこという新規の知見が得られた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、ヒト脂肪前駆細胞とヒト血管内皮の細胞老化誘導のシステムを中心に、bulk-RNA-seqとbulk-ATAC-seqを用いた細胞老化関連 lncRNAの同定をさらに進める。またp53依存的細胞老化関連lncRNA（5遺伝子）の結合因子を同定し、細胞老化誘導後の脂肪細胞と血管内皮を用いて、ビオチン標識したプライマーにより試験管内で転写し、pull-downを行ってセンス鎖、アンチセンス鎖それぞれの相互作用因子を、LC-MS/MSで同定する。同定した因子群をGene Ontology解析で絞り込み、特にエピゲノム制御に関わるタンパクに焦点を当て、lncRNA複合体のインタラクトーム解析を行う。またsiRNAあるいはCRISPR/Cas9を用いた実験で機能的validation解析を行う。
|
