2021 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of the pathophysiology of OA fibrosis and establishment of therapeutic methods using innovative imaging technology and single-cell analysis
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21H03056
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
今村 健志 愛媛大学, 医学系研究科, 教授 (70264421)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川上 良介 愛媛大学, 医学系研究科, 准教授 (40508818)
齋藤 卓 愛媛大学, 医学系研究科, 講師 (60588705)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | イメージング技術 / 一細胞解析 / 変形性関節症 / 線維化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、変形性関節症（OA）の線維軟骨形成について、慢性炎症のキープロセスである線維化（fibrosis）の視点でアプローチし、革新的イメージング技術を駆使した細胞動態解析によって、線維芽細胞の起源としてCAR（CXCL12-abundant reticular）細胞、線維化を増長する悪玉線維芽細胞としてTHY1陽性細胞の関与を明らかにする。さらに、一細胞解析を用いた遺伝子発現プロファイルによって、線維化に関わる多様な細胞の新たなサブタイプを同定し、その制御に関わる細胞間ネットワークを明らかにする。
in vivoの細胞動態実験については、まず、I型コラーゲンプロモーター支配下に緑色蛍光タンパク質（GFP）が発現するマウス(ColI-GFPマウス)、橙色蛍光タンパク質（Kusabira-Orange; KO）をCXCL12 locusにノックインしたマウス(CAR-Orangeマウス)とTHY1プロモーター支配下に黄色蛍光タンパク質（YFP）が発現するマウス(H-lineマウス)の繁殖を開始し、それぞれ全身での発現を解析し、ColI-GFPマウスでは皮膚および腸管の線維芽細胞での発現、CAR-Orangeマウスでは脳を含む血管周囲の細胞での発現、H-lineマウスでは神経細胞の一部と骨髄の細胞の一部、リンパ節の細胞の一部での発現を確認した。OA手術を施行については、術後の２光子励起蛍光顕微鏡を用いた生体イメージングが困難であった。SHGによるコラーゲンイメージングについては偏光方向イメージングで定量化を試みた。組織透明化については、まず胎児を使って骨・軟骨の透明化を試みたが、当初予定したLUCID法では骨・軟骨の透明化の効果が弱かったので、CUBIC法の条件設定を行なった。２光子励起ライトシート顕微鏡を用いた高精細3Dイメージングシステムを構築した。一細胞解析のための準備、特に細胞分離と解析の条件設定を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
in vivoの細胞動態実験については、イメージング用の４種類のマウス、I型コラーゲンプロモーター支配下に緑色蛍光タンパク質（GFP）が発現するマウス(ColI-GFPマウス)、橙色蛍光タンパク質（Kusabira-Orange; KO）をCXCL12 locusにノックインしたマウス(CAR-Orangeマウス)とTHY1プロモーター支配下に黄色蛍光タンパク質（YFP）が発現するマウス(H-lineマウス) 全てを準備して繁殖を開始し、それぞれ全身での発現を解析できたので、おおむね順調に進展している。OA手術を施行については、術後の２光子励起蛍光顕微鏡を用いた生体イメージングが困難である問題が生じたが、手術方法の改良案を準備し、次年度に引き続き研究を進める。SHGによるコラーゲンイメージングについては偏光方向イメージングでの定量化が、おおむね順調に進展している。組織透明化については、まず胎児を使って骨・軟骨の透明化を試みたが、当初予定したLUCID法では骨・軟骨の透明化の効果が弱かったので、CUBIC法の条件設定を行ない、おおむね順調に進展している。２光子励起ライトシート顕微鏡を用いた高精細3Dイメージングシステムを構築できたので、おおむね順調に進展している。一細胞解析のための準備、特に細胞分離と解析の条件設定を進めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
in vivoの細胞動態実験については、イメージング用の４種類のマウス全て揃っているので、前年度に引き続き、繁殖を進め、それぞれ全身での発現解析を行う。
OA手術については、前年度で明らかになった問題点の改善を行い、術後の２光子励起蛍光顕微鏡を用いた生体イメージングの条件を検討する。
SHGによるコラーゲンイメージングについては、前年度に引き続き、偏光方向イメージングで定量化を試みる。
組織透明化については、前年度で明らかになった問題点の改善を行い、CUBIC法の条件設定を進める。
２光子励起ライトシート顕微鏡を用いた高精細3Dイメージングシステムについては実際の軟骨でのイメージングを試みる。
前年度に引き続き、一細胞解析のための準備、特に細胞分離と解析の条件設定を進める。
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