高静水圧処理を応用した皮膚、骨、神経の再生~自家腫瘍組織の再生医療への応用

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21H03099
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 森本 尚樹 京都大学, 医学研究科, 教授 (40378641)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 仲野 孝史 京都大学, 医学研究科, 特定病院助教 (50892634) ; 山中 浩気 京都大学, 医学研究科, 助教 (70760833) ; 片山 泰博 京都大学, 医学研究科, 特定病院助教 (80842434)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 高静水圧処理 / 不活化 / 再利用 / 自家組織

Outline of Annual Research Achievements

令和3年度に、クラウンミニブタ腹部皮膚を採取し、アポトーシス皮膚（50MPa、36時間）を作成し、アポトーシスを起こしていることを確認したが、高圧処理後の皮膚から線維芽細胞の遊走がみれれたため、移植実験を実施することができなかった。従って、今年度は皮膚の検討を行わず、骨及び神経再生への応用を優先して実施することとした。高圧処理の骨への応用の基礎検討として以下の項目で実施した。
1.正常骨の高圧処理による不活化、細胞成長因子評価
Wisterラット頭蓋骨及び大腿骨を採取、破砕後、3群の不活化処理として、高静水圧処理（200MPa、10分）、高温処理（80度、30分）、凍結処置（-196度、20分）及び未処理骨の4群で検討を行った。この結果、高静水圧処理、高温処理、凍結処理でexplant培養で細胞遊走がないことを確認でき、WST-8法による生細胞測定でも生細胞はないことが確認できた。細胞成長因子定量について、骨のホモジナイズ後、BMP2、VEGFの定量（ELISA法）を行ったが測定限界以下であり、骨成長因子にの評価については別の方法が必要と考えられた
2.骨悪性腫瘍モデルでの高圧処理の有効性の確認
高圧処理（200MPa、10分）によって、骨悪性腫瘍細胞（LM8、骨肉腫株細胞）が死滅し増殖しなくなること、免疫不全マウス（ヌードマウス）に高圧処理を行った腫瘍細胞を移植しても腫瘍形成をしないことを確認した。
神経への高圧処理の応用について、ラット及びブタから神経を採取し、高静水圧処理（200MPa、10分）によって、組織構造に変化がないことを免疫染色及び電顕画像で確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

正常骨の高圧処理による不活化、細胞成長因子評価については、骨不活化の確認は実施でいたが、細胞成長因子定量について、骨のホモジナイズ後、BMP2、VEGFの定量（ELISA法）を行ったが測定限界以下であり、骨成長因子にの評価については別の方法が必要と考えられた。.骨悪性腫瘍モデルでの高圧処理の有効性の確認、については高圧処理（200MPa、10分）によって、骨悪性腫瘍細胞（LM8、骨肉腫株細胞）が死滅し、免疫不全マウス（ヌードマウス）に移植を行っても腫瘍形成をしないことが確認できた。神経への応用について、ラット及びブタから神経を採取し、高静水圧処理（200MPa、10分）によって、組織構造に変化がないことを免疫染色及び電顕画像で確認した。以上からおおむね順調に進展できたと考えている。

Strategy for Future Research Activity

骨の不活化処理後に残存する細胞成長因子比較実験について、正常骨から細胞成長因子を抽出する方法ではなく、細胞成長因子を不活化処理し、処理後の細胞成長因子活性を評価する方向で検討する予定である。神経不活化については、今後動物での移植実験を開始する。