2021 Fiscal Year Annual Research Report
動的ゴーストイメージング技術を用いた高骨形成細胞集団の分取と機能的再生骨の実現
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21H03136
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
星 和人 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (30344451)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
浅輪 幸世 東京大学, 医学部附属病院, 特任講師 (10769912)
疋田 温彦 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (60443397)
西條 英人 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (80372390)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 骨再生 / 細胞分離 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
優れた骨再生を実現するための細胞群の同定のため、まず、マウス骨髄をフラッシュして採取した直後の骨髄細胞を、1．そのまま播種したもの、2．赤血球を破砕したもの、3．Ficollを用いた密度勾配遠心で単核細胞を分離したものについて、in vitroでの検討を行った、具体的には、これらの方法で分取した細胞を一定期間増殖させた後に、β-Glycerophosphate、アスコルビン酸を添加した培地で骨芽細胞分化培養を行い、アルカリフォスファターゼ染色、アリザリンレッド染色を行って骨形成能を比較した。その結果、赤血球を破砕したもので最も良好な石灰化結節の形成が認められた。Ficollを用いた分離法においては細胞数が少ないことが問題になることが示唆された。
また、その中に含まれる骨形成能の高い細胞集団を同定する方法として、細胞分裂速度の違いによる細胞の分取法を検討した。間葉系幹細胞を蛍光試薬CFSEを用いて標識し、一定期間培養したのちに、Flow cytometryを用いた解析を行った。その結果、細胞分裂速度の違いにより細胞当たりの試薬の希釈の程度が異なることで、蛍光強度を示すヒストグラムが幅広く分布することを確認した。
また、自己組織化ペプチドハイドロゲル(PuraMatrix)、アテロコラーゲンを用いて細胞を懸濁し、作製した細胞含有ゲルをin vitro分化培養、あるいはマウスへの移植を行い、回収して病理理組織切片を作製し、組織形成を比較検討し、ゲルの素材の違いによる組織成熟の様式について解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2021年度に骨形成能の高い細胞の分取法の検討を行い、2022年度に行う予定のGhost Cytometryを用いた骨形成能の高い細胞の分取法確立に向けた準備が進んでいる。また、ゲル仕様の決定については、2021年度にin vitro, 2022年にin vivoの検討を行う予定であったが、既にin vivoでの検討を開始している。
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| Strategy for Future Research Activity |
Ghost Cytometryを用いた骨形成能の高い細胞の分取法確立：骨再生能の高い細胞集団を、前年に検討した方法で分取し、教師データとしてGhost cytometerにおいて形態情報を学習させる。次に、学習した形態情報を基に目的の細胞群を骨髄単核細胞からGhost cytometryを用いて分取を行い、蛍光標識された細胞が分取される割合を確認する。目安としては標識細胞のうち70~80％が分取細胞に含まれている状態を目指す。分取した細胞を、アスコルビン酸、βGlycerophosphateを含む分化培地を用いて骨芽細胞分化させ、細胞染色やrealtime RT-PCRによる分化マーカーの解析を行う。分取した細胞が、分取前の細胞に比較して骨芽細胞分化能が高いことを確認する。
ペプチドハイドロゲルの仕様決定（in vivo）：候補仕様のゲルを、最適な濃度の細胞（MC3T3細胞、初代骨芽細胞、軟骨細胞等）と混和し、ゲル化する前にマウス頭蓋皮下の骨上あるいは背部皮下に注入する。4~8週後にマウスを安楽死させ、肉眼的に移植物の残存やその形状を確認後、組織を採取する。組織切片を作製し、Hematoxylin & Eosin染色などによる組織学的評価を行い、骨再生を確認する。
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