2022 Fiscal Year Annual Research Report
Vulnerability of bacterial community to antibiotics in aquatic environments and its effect on biogeochemical processes
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21H03608
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
濱 健夫 筑波大学, 生命環境系, 名誉教授 (30156385)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
辻村 真貴 筑波大学, 生命環境系, 教授 (10273301)
須田 亙 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 副チームリーダー (20590847)
渡邊 圭司 埼玉県環境科学国際センター, 水環境担当, 専門研究員 (50575230)
大森 裕子 筑波大学, 生命環境系, 助教 (80613497)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 抗生物質 / 細菌群集 / 遺伝子解析 / 多様性 / 有機物分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌自然群集に対する抗生物質の影響を評価するため、河川水（綾瀬川・中の橋）および湖水（霞ヶ浦・行方）を用いた培養実験を実施した。採取した試水に、テトラサイクリンの最終濃度が、0、1 ng/L、100 ng/L、10 ug/L、1 mg/Lおよび10 mg/Lとなるよう添加し、20℃で暗所において9日間培養した。0日、2日および9日後に試料の一部を採取し、試料に含まれる細菌群集を3 um以上の画分に含まれる付着性細菌と、3 um未満の画分の遊離性細菌に分別し、それぞれについてDNAを抽出した。得られた試料を用いて、16s rRNAの塩基配列に基づく群集組成を明らかにした。また、培養中の有機物の分解に対する影響を評価するため、分解速度の高いクロロフィルaの濃度変化を明らかにした。
主座標分析を用いた群集組成の類似性の検討の結果、綾瀬川から得た遊離性細菌では100 ng/L、付着性細菌では1 mg/L以上の濃度のテトラサイクリンにより、群集組成が変化することが明らかになった。一方、霞ヶ浦の試料に関しては、遊離および付着性細菌の群集組成に影響を与える濃度は、それぞれ1 mg/Lおよび10 mg/Lであった。
群集の多様性を示すShannon指数は、テトラサイクリンの濃度に依存して減少する傾向にあった。9日目の試料では、綾瀬川の遊離性細菌群集では100 ng/Lから、付着性群集では1mg/Lから低下が確認された。一方、霞ヶ浦から得た群集では、遊離性および付着性群集共に、10 mg/Lにおいて多様性が低下した。
培養実験中にクロロフィルa濃度は、細菌による分解作用を反映して低下した。低下の割合はテトラサイクリンの添加量により異なり、添加量が増加するに従い、残存量が増加することが認められた。これは、高濃度のテトラサイクリンの添加が、バクテリアの分解活性を抑制していることを示唆する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度の抗生物質の濃度の測定結果に基づき、綾瀬川と霞ヶ浦を対象に抗生物質添加実験を実施した。添加実験では、それぞれの対象水域について、3 Lの培養器を合計18基用いたが、試料の分注、抗生物質として用いるテトラサイクリンの添加、試料の採取および処理は順調に進行した。
群集組成を明らかにする遺伝子解析は、各条件で得られた試料について、研究計画通り、付着性細菌と遊離性細菌それぞれについて実施した。また、再現性確認のため各条件で3系列の培養系を設定したが、本年度は、各試料ともに1系列の倍養について遺伝子解析を実施することとした。
遺伝子解析の結果を基に行った主座標分析から、エリスロマイシンの添加量に依存して、細菌自然群集組成が変化することを明らかにすることができた。また、解析により確認された分類種（OTUs）数および多様性指数から、抗生物質の添加が多様性を低下させることも確認された。さらに、抗生物質の影響は、付着性細菌と遊離性細菌では異なることも示唆された。これらの結果は、細菌自然群集に対する抗生物質の影響を評価するために、本研究で計画、実施した培養実験が、有効であることを示している。
物質循環に対する影響に関しては、細菌により分解されやすいクロロフィルa濃度を用いることに着目した。測定の結果、抗生物質濃度の増加に対応して、細菌の分解活性が低下することを明確に示すことができた。
一方、遺伝子解析を行った試料が各条件で1試料であったため、群集組成の変化等ついての統計的解析には至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の培養実験で得られた一部の試料に関する分析結果は、綾瀬川および霞ヶ浦試料を用いた培養実験が、計画通り実施できたことを示している。このため、最終年度の3年次においては、2年次に実施した培養実験で得られた試料の分析を継続し、得られた結果を用いて統計的解析を含めた総合な検討を実施する。
具体的には、培養実験で得られた3系列の培養試料の残り2系列の試料に関して、DNAの抽出とそれを用いた遺伝子解析を実施する。得られた結果を元に、主座標分析、α多様性およびβ多様性の評価行い、自然細菌群集に影響を及ぼすエリスロマイシンの濃度を特定する。また、多様性に関するShanon指数およびChao1指数の変化を統計処理し、多様性の低下とエリスロマイシン濃度との関係を明確にする。さらに、具体的な群集組成変化に関しては、同一条件の3試料から得られた結果を基に、感受性の高い分類群、および低い分類群を、付着性細菌および遊離性細菌のそれぞれについて特定する。
物質循環への影響に関して、更に詳細な情報を得るために、懸濁試料に含まれる炭水化物の分析を新たに実施する。細菌による分解作用に対する抗生物質の影響を評価する。
得られた結果をとりまとめた上で、学会において発表すると共に、論文を投稿、発表するする。
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