2022 Fiscal Year Annual Research Report
New field of managing microbes: Elucidation of electrically metabolic switching mechanisms
| Project/Area Number |
21H03633
|
|---|
| Research Institution | Shizuoka University |
|---|
Principal Investigator |
二又 裕之 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 教授 (50335105)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田代 陽介 静岡大学, 工学部, 講師 (30589528)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 代謝 / 硫酸還元細菌 / 細胞外電子伝達 / 微生物燃料電池 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
生物学的廃水処理、環境浄化およびエネルギー生産は、社会基盤を支える重要な技術であり、それらの安定的制御あるいは更なる効率化は必須の課題である。これらの技術の根幹は微生物の代謝にある。そこで本研究では、微生物代謝を自在に発現制御可能とする新規技術の構築を目標とする。特に、嫌気環境微生物の代謝制御は、エネルギー低負荷型技術の開発にとって必要不可欠である。代表的嫌気微生物である硫酸還元微生物は、有機物分解や金属腐食に深く関与する善悪両面から注目すべき微生物の一つである。昨年度までに、硫酸還元微生物HK-II株の細胞外電子伝達最適電位（+0.4 V [vs SHE]）およびゲノム完全長解読に成功した。そこで今年度は、硫酸還元状態を対照とし最適電位条件下での細胞外電子伝達における網羅的転写遺伝子解析を実施した。
EET条件において3つの繊毛形成遺伝子Flp/PilAが高転写していた。EETモデル微生物であるGeobacter sulfurreducens PCA株は導電性線毛のPilAを介してEETを行う為、HK-II株のPilAについて導電性の有無、構造および系統学的な観点からPilAによるEETを評価した。経験則的基準に基づく評価では導電性は予測されなかった。AlphaFold2による構造予測では、3つのPilAおよびPCA株のPilA-Nは類似構造を示した。一方、PCA株のPilA-Cの構造はHK-II株のPilAには見られなかった。また、PilA-CのBLAST検索を行ったところ、HK-II株のゲノム情報に対して相同な塩基配列も確認されなかった。系統学的解析では、T4aP、T2SSおよびPilA-N-Cと進化距離が離れていることが明らかとなった。以上のことから、HK-II株のPilAが導電性を有する場合、PCA株のPilAとは一線を画す新規導電性線毛の可能性が示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和4年度の研究スケジュールでは、硫酸還元条件下および細胞外電子伝達時における網羅的転写遺伝子解析、および、それに付随する推定された代謝制御遺伝子の転写活性個別解析が実施内容として設定されている。電気的代謝スイッチング制御機構解明の為には、対象微生物である硫酸還元細菌HK-II株の細胞外電子伝達（EET）時における代謝を理解する必要があった。その為、昨年度までにEETにおける最適電位およびHK-II株のゲノムの完全長解読を実施し、それらの知見をベースに今年度、最適電位における網羅的転写遺伝子解析について硫酸還元状態を対照として実施した。EETを行う微生物は多数報告されているものの、具体的に何が生じているのかを示した研究事例は未だ限られている。今年度の解析によって、EET条件においてHK-II株は繊毛形成遺伝子を極高転写していることが示され、高く評価され得る。一方、これらの知見を基にした変異株作出については種々の条件を検討しつつ現在進めているところである。よって、研究全体としてはおおむね順調に進展していると判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
網羅的転写遺伝子解析の結果、HK-II株のPilAが細胞外電子伝達に関与していることが推察された。一方、諸々の解析からPilA自体が導電性を示す可能性を見出すことはできておらず、細胞外電子伝達機構の理解には未だ至っていない。一方、PilAに導電性タンパク質が結合することによりEET能を発揮しているとの報告がなされていることから、トランスクリプトーム解析に供試した時と同様の培養条件でHK-II株を培養し、EET条件下および硫酸還元条件下における細胞を外膜、細胞質、内膜とペリプラズムの３つに分画し、細胞外電子伝達に関与すると推定されているcytrochrome cタンパク質を選択的に染色するヘム染色方法により特定のタンパク質を検出し、LC-MS/MS解析によってタンパク質の同定並びに分子量からそれらをコードする遺伝子を推定する。推定された遺伝子が目的の機能をコードしているのかどうかを確認する為には、対象とする遺伝子の破壊株を作出する必要がある。一般的に嫌気微生物の遺伝子操作技術はほとんど確立されておらず、我々の対象微生物も同様である。そこで、CRISPR-Cas9による遺伝子編集技術を用いた変異株作出技術の構築を並行して進める予定である。
|
