2023 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノム編集ツール臓器内直接送達システムによる生体内ダイレクトゲノム編集技術の開発
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21H03797
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
小暮 健太朗 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (70262540)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
南川 典昭 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (40209820)
野村 渉 広島大学, 医系科学研究科(薬), 教授 (80463909)
福田 達也 和歌山県立医科大学, 薬学部, 講師 (90805160)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | イオントフォレシス / ゲノム編集 / 微弱電流処理 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ゲノム編集ツールCRISPR-Cas9複合体（リボヌクレオプロテインRNP）を標的臓器細胞内へ直接送達可能な新規物理的送達システムの開発により、安全で効率的な生体内ダイレクトゲノム編集技術の確立を目的とした。研究代表者は、皮膚表面から微弱電流による皮内薬物送達技術（イオントフォレシスItP）により、皮膚のみならず肝臓表面からの直接的なsiRNA送達による遺伝子発現抑制に成功したことで、ItPによるin vivoダイレクトゲノム編集を発想した。だが巨大なRNPのItPには、臓器・細胞内送達の技術革新が必須なため、本研究ではRNPの臓器内浸透、細胞内取込とエンドソーム脱出の達成により、in vivoダイレクトゲノム編集技術を確立し、疾患モデルでの治療効果の検証から本システムの完成を目指した。
本年度は、本課題の肝となるRNPの微弱電流によるゲノム編集の詳細な条件検討（in vitro）、を実施した。これまで、微弱電流処理48時間後にT7E1アッセイを行いゲノム編集を評価したところ、クロロキン共存下で切断バンドと思われるものが得られていたが、明確ではなかったため、細胞から回収したDNAをポリアクリルアミド電気泳動後に切り出したバンドから精製したものを用いて、検討を行った。また、細胞を微弱電流処理する時にRNPを存在させておくと、電極にRNPが引き寄せられ、細胞内に取り込まれていない可能性が考えられたため、微弱電流処理後に細胞に添加する方法に変更した。その結果、RNPを存在させることで、スメアなバンドが見られたことから、少なくともGas9が細胞質まで送達されることで、ゲノムが切断できていることを確認することができた。本年度で本科研費は終了するが、引き続き本課題を継続し、詳細な条件検討を行うことでダイレクトゲノム編集技術を確立したいと考えている。
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| Research Progress Status |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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