2022 Fiscal Year Annual Research Report
Development of ultrasensitive detection method for call membrane antigen and its application to cancer companion diagnosis
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21H04686
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
片山 佳樹 九州大学, 工学研究院, 教授 (70284528)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
馬場 英司 九州大学, 医学研究院, 教授 (00315475)
森 健 九州大学, 工学研究院, 准教授 (70335785)
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| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2024-03-31
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| Keywords | がんコンパニオン診断 / 酵素増感法 / 膜抗原 / フローサイトメトリー / ELISA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では細胞膜抗原の高感度検出法の開発と、それを用いたがんコンパニオン診断の開発を目的としている。2022年度は、昨年度、探索したヒト直交性酵素に関し、診断法への適用における性能を評価した。見出した8種の酵素に関して、タイプの異なるヒト細胞株(JY25, HeLa, HepG2, MCF-7)を用いて、生細胞、細胞破砕液（pH 7.4あるいは4.5）で内在活性を評価した。臨床診断に汎用される酵素も同時に評価したところ、これらの汎用酵素では、用いた細胞全てで内在活性が確認されたが、見出した8種の酵素では、内在活性が認められず、ヒト直交性酵素であることが確認できた。酵素活性の評価から、何れも診断に適用可能な活性を有していることが分かった。α-ラムノシダーゼについては由来の異なる2種の酵素を取得した。活性はいずれも診断への適用の条件を満足していたが、一方は、細胞に対する非特異吸着が確認されたため、非特異吸着が見られなかったものを用いることとした。とくにすぐれた性能を有すると期待できるα-アラビノフラノシダーゼ、α-ラムノシダーゼ、β-キシロシダーゼについて基質プローブを合成して、Cell ELISAにて細胞膜抗原の検出を試みたところ、Her3、EpCAMの検出を対象とする評価で、いずれも優れた検出能を示した。しかも、従来の診断用酵素に比べ高いS/N比を示した。
次に、上記の3種の新規酵素に対する蛍光基質型分子プローブを開発し、合成に成功した。いずれも、3種の酵素間での交差反応性は全くないことも評価した。EGFR、Her3、EpCAMの同時検出を試みたところ、HepG2を用いて同時検出にも成功した。現在、この3種の酵素に対して多色型、かつ反応後に細胞に集積できるCLAMP型基質の合成を実施中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的であるがんコンパニオン診断における細胞膜抗原の検出では、複数のコピー数の少ない膜抗原を同時に検出することが必須であり、そのためには、内在活性の存在しない新規な診断用酵素が複数必要であったが、当該年度の研究により、この目的が完全に達成された。特に8種のうちの最も有望な3種の酵素を用いての評価で、安定性、非特異吸着、活性、交差反応性のいずれの条件でも理想的な診断用酵素としての性能を得ることができた。また、この3種の酵素で実際に3種の異なる膜抗原を同時に検出することにも成功し、本研究の目的達成のための大きなハードルの一つをクリアできた。さらに、複数抗原同時検出に必要な多色の基質型蛍光プローブの合成法にもめどがつき、細胞集積型ではないが、Cell ELISAでは、実際に診断へのめどがついた。このような理由により、当初の計画以上に研究が進展したと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、細胞集積型のCLAMP法に適用できる多色型蛍光プローブを開発し、2022年度に開発した酵素と組み合わせて、まず、がん細胞の上皮/間葉系転移の検出評価に適用して、その性能を実証し、さらに固形がんのコンパニオン診断の評価のため、がんの診断に適用して、その基礎概念を確立していく。
すなわち、上皮系マーカと間葉系マーカーの検出にα-アラビノフラノシダーゼ、α-ラムノシダーゼ、β-キシロシダーゼ、およびそれぞれに対する青、緑、赤の蛍光型基質プローブを適用して、まず、Cell ELISAにて、がん細胞に間葉系転移を誘導して、その発現変化を検出して、実用性を検証する。また、3色のCLAMP型基質の合成を完了して、先述の3種の酵素に適用し、フローサイトメトリーによって上皮/間葉系転移の評価を行い、実用性を検証する。その後、オプジーボやセツキシマブなどに対する奏効率を左右するマーカーとなる膜抗原の検出に適用して、その性能を検証することで、本法のがんコンパニオン診断の基礎を確立する。
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