2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of functional fluorescent probe for imaging osteocyte function and 4D nucleomics
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21H04706
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
菊地 和也 大阪大学, 大学院工学研究科, 教授 (70292951)
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| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2024-03-31
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| Keywords | 化学プローブ / 蛍光イメージング / 蛋白質ラベル化 / 破骨細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細胞内分子機能解明に加え生物個体における細胞機能を観察できる化学ツールの設計法を確立する。これまでの蛍光プローブ開発の発展型として化学分子設計と蛋白質科学技術と融合することで、in vivo解析へ応用可能な化学プローブへと深化させる。最終的にこれらのプローブを細胞から動物個体へ応用し、生物学における問題解決を目指す。
本年度では(i)骨細胞機能を明らかにする二光子励起in vivoイメージングプローブの開発、および(ii)蛋白質の機能性分子ラベル化技術の開発によるオルガネラ成熟時の局所pH計測プローブの開発を進めた。(i)においては、従来の蛍光強度増強型のプローブでは達成できなかった骨組織におけるpHの定量評価系の確立のため、pHの低下により蛍光波長がシフトするレシオ型蛍光プローブの開発に取り組んだ。pHによって吸収が変化する色素をアクセプター色素としたFRET型のプローブを設計、合成した。ドナー側の色素を検討したところ、クマリン誘導体が破骨細胞が形成する低pH領域に応答してアクセプター側の色素とFRETを起こし、蛍光波長が変化することを確認した。
(ii)においては、細胞外から物質を取り込むエンドサイトーシスにおいてエンドソームからリソソームへの成熟過程でpHが低下する様子を観察するため、タンパク質にタグを介してpH応答性のプローブをラベル化する手法の開発を行った。われわれの研究室で独自に開発したPYPタグによるラベル化法を用いるため、PYPのリガンドにpH応答性蛍光色素を導入したプローブを設計・合成した。本プローブはラベル化時に蛍光強度が上昇するだけでなく、pHに応答して蛍光波長がシフトすることが観察された。また、PYPタグのリガンドについて検討したところ、効率よくラベル化が起こる新たなリガンド構造を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
両課題とも目的のpHで応答する色素、タンパク質への標識が可能なプローブの合成を達成しており、性質も目的に見合うものができていることから、おおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
前者の課題に関しては、骨組織へと分子を標的化するための官能基（ビスフォスフォネート基）を導入したレシオ型蛍光プローブの開発を進める。プローブが完成次第、生きたマウスに本プローブを投与し、骨組織における各波長における蛍光シグナルの変化を二光子励起顕微鏡を用い長時間イメージングする。また、得られた蛍光シグナルを解析することで、pH変化を可視化計測する。
後者の課題に関しては、生細胞内のエンドサイトーシスの過程でのpH変化のマルチカラーイメージングに取り組む。加えて、前年度見出したPYPタグの新規リガンドについてさらなる検討、構造最適化を進める。
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