白色腐朽菌の環境汚染物質代謝能の意義解明及び汚染環境浄化への発展的応用

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21H04744
• Research Institution: Shizuoka University
• Principal Investigator: 平井 浩文 静岡大学, 農学部, 教授 (70322138)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 一瀬 博文 九州大学, 農学研究院, 准教授 (00432948) ; 鈴木 智大 宇都宮大学, バイオサイエンス教育研究センター, 准教授 (10649601) ; 長井 薫 千里金蘭大学, 生活科学部, 教授 (20340953) ; 森 智夫 静岡大学, 農学部, 准教授 (80536516)
• Project Period (FY): 2021-04-05 – 2025-03-31
• Keywords: バイオレメディエーション / 白色腐朽菌 / シトクロムP450 / 毒性評価

Outline of Annual Research Achievements

(1) 環境汚染物質代謝CYPライブラリーの構築
本研究の供試菌であるPhanerochaete sordida YK-624株は214種のシトクロムP450（CYP）遺伝子を有している。これらCYPが代謝可能な環境汚染物質を決定することで、環境汚染物質代謝CYPライブラリーを構築することを目的に、P. sordida YK-624株からのCYP遺伝子（cDNA）の取得を行った。ポテトデキストロース液体培地で供試菌を培養し、得られた菌体よりtotal RNAを抽出後cDNA化し、これをテンプレートとして、各CYP取得用プライマーを用いてPCRを行った。また一部のCYPにおいてはNested PCRも行い、遺伝子取得を行った。その結果、本年度は104種類のCYP cDNAの取得に成功した。さらにCYP reductase（CPR）遺伝子も取得し、CYP/CPR共発現プラスミドを構築した。本プラスミドが機能するかどうか確認するため、既にアセタミプリド（ACE）の代謝が報告されているCYPを本プラスミドに導入し、これを酵母Saccharomyces cerevisiae AH22株に形質転換し、本酵母によるACEの代謝を試験した結果、本酵母によりACEの代謝が認められたことから、CPRが活性型になっていることを確認した。
(2) P. sordida YK-624株の与える分解代謝産物の生物学的意義の解明
『白色腐朽菌は環境汚染物質を、環境中に存在する微生物が分解可能となる形にまで代謝している』という仮説を証明すべく、本年度はネオニコチノイド系殺虫剤であるイミダクロプリド（IMI）の代謝産物である5-hydroxy IMIの合成を行い、完了した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「環境汚染物質代謝CYPライブラリーの構築」については、P. sordida YK-624株が有するCYP遺伝子の半数の取得に成功し、その発現系構築も完成した。また「P. sordida YK-624株の与える分解代謝産物の生物学的意義の解明」においては、分解代謝産物の合成にも成功した。よって、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後はP. sordida YK-624株が有するCYP遺伝子を全取得し、本遺伝子を発現する酵母の作出を完了する。
また、P. sordida YK-624株の与える分解代謝産物の生物学的意義の解明については、土壌微生物による処理を開始し、分解毒性、微生物群解析、発現遺伝子解析等を実施する。