2021 Fiscal Year Annual Research Report
革新的な機能調節化合物の創製による概日時計システムの統合的な理解と制御
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21H04766
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
廣田 毅 名古屋大学, トランスフォーマティブ生命分子研究所, 特任准教授 (50372412)
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| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2024-03-31
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| Keywords | 概日時計 / ケミカルバイオロジー / 時計タンパク質 / 化合物 / 構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
概日時計は多様な生理機能の日内リズムを支配し、その攪乱は睡眠障害などの現代疾患に関連する。本研究は概日時計の分子解析から、生物がどのように時間を計るのかという本質的な謎を解明し、概日リズムの変調と諸疾患を時間の観点から理解することを目指す。この重要課題に対して、時計機能の操作技術の開発が突破口を開くと考え、ケミカルバイオロジーを応用した研究を行う。申請者が世界に先駆けて発見した独自の時計調節化合物を用い、新たな時計タンパク質の発見や、概日リズムの時空間制御を可能にする新技術を開発する。これらの革新的な技術を用いて、結晶構造解析による分子メカニズム解析から組織・個体における機能制御を統合的に行い、従来の分子遺伝学研究を超えて概日時計システムの作動原理を徹底解剖する。本年度は光スイッチであるアゾベンゼンを時計調節化合物のlongdaysinに導入した化合物を用いて、CKIの活性と細胞集団の概日リズム周期を光によって可逆的に制御することに成功した。さらに、CRY1とCRY2のそれぞれにアイソフォーム選択的に作用する化合物のKL101とTH301について、化合物結合ポケットにおける内在的な違いに注目して構造解析を進めた。その結果、ゲートキーパーと名付けたトリプトファンの向きの違いがアイソフォーム選択性を生み出すことを見出した。すなわち、トリプトファンがCRY1では外に、CRY2では内に向いており、それぞれのトリプトファンと特異的に相互作用しているアミノ酸をアラニンに置換したところ、KL101とTH301への選択性が逆転することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
下記のように研究2および研究3において当初の計画以上に研究が進展した。
研究2では、概日時計の周期を強力に延長する化合物として以前に見出したlongdaysinに対して光スイッチであるアゾベンゼンを導入した誘導体を多数開発し、それらの中から標的タンパク質であるCKIの活性を光による構造変化に依存して可逆的に抑制する化合物を見出した。さらに、この化合物を培養したヒト細胞に投与して光照射を行うことにより、概日リズムを集団レベルにおいて可逆的に変化させることに成功した。
研究3では、CRY1とCRY2のそれぞれのアイソフォームに選択的に作用する化合物として以前に見出したKL101とTH301を用い、選択性を生み出す分子基盤に迫った。化合物と相互作用するアミノ酸の配列はCRY1とCRY2の間で同一であったものの、側鎖の向きが異なることを見出した。さらに、化合物と結合していないアポ型のCRY1とCRY2の結晶構造を決定することで、ゲートキーパーと名付けたトリプトファンの向きの違いがCRYアイソフォームに内在的であることを明らかにした。それぞれのトリプトファンと特異的に相互作用するアミノ酸をアラニンに置換することにより、ゲートキーパーがKL101とTH301の選択性を決定していることを機能的にも示した。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究1-3において、計画通りに研究を推進する。
研究1では新規の概日時計調節化合物について、作用機序の解析を進める。アフィニティープローブの開発を進めると共に、時計タンパク質と化合物の相互作用を熱安定性の変化によって検出する系を用いた解析を行う。
研究2では概日リズムの一細胞レベルでのイメージングシステムを用いてヒト細胞を培養し、これまでに開発した光スイッチ化合物を投与して局所的な光照射を行うことにより、概日リズムの空間的な制御を試みる。そのための光照射条件などの検討を行う。
研究3ではCRY1とCRY2のアイソフォーム選択性に注目した機能および構造解析を進める。特にゲートキーパーの役割に関して、KL101やTH301以外の化合物についての解析を行う。CRYに作用する化合物のアイソフォーム選択性の精査、CRYタンパク質との複合体の結晶構造解析、およびゲートキーパーに影響を与える変異体の機能解析を組み合わせる。
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