2021 Fiscal Year Annual Research Report
DNA複製と共役する姉妹染色分体間接着機構の一分子動態理解
| Project/Area Number |
21H04767
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
西山 朋子 名古屋大学, 理学研究科, 客員教授 (90615535)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2026-03-31
|
| Keywords | 姉妹染色分体間接着 / DNA複製 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
すべての真核生物において、複製されたDNA同士はかならず接着される。この姉妹染色分体間接着における原則は、真核生物のゲノム均等分配を支える基本原則でありながら、その分子メカニズムが明らかになっていない。本研究では、接着確立因子Sororinの複製依存的なローディング機構と、接着を担うコヒーシン複合体の構造変化に着目し、細胞生物学、生化学的手法と一分子解析手法を組み合わせることにより、DNA複製依存的に確立される接着機構の全容を一分子レベルで理解することを目指す。 本年度はSororinローディング機構の解明の準備に取り組んだ。ヒトSororin－GFPを恒常的に発現するヒトHeLa細胞およびショウジョウバエDalmatian-GFP発現ショウジョウバエS2細胞の作製を行った。アフリカツメガエル卵抽出液からのSororin-GFPタンパク質を用いたプルダウンアッセイを行った結果、複製因子C（Replication Factor C）複合体をはじめ、Sororin結合因子が複数同定された。すでにSororinとの結合が報告されているコヒーシン複合体サブユニットも複数検出されたことから、プルダウン系は正しく機能していると考えられるが、ツメガエル卵抽出液では核／細胞質比が体細胞と大きく異なるため、DNA複製に関わる因子の濃度も低く、DNA複製期に接着を確立することが示唆されているSororinの機能を正しく解釈できない可能性が危惧された。そのため、核／細胞質比を増加させた実験系で検証を行う必要性が示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はSororinローディング機構の解明の準備に取り組んだ。これまでの研究で、アフリカツメガエル卵、ヒト体細胞、ショウジョウバエ細胞において、Sororin（ショウジョウバエオーソログはDalmatian)がDNA複製依存的に接着を確立することが分かっている。これらの研究に基づき、高等真核生物に共通の接着確立機構を明らかにするため、ヒト体細胞、ショウジョウバエ体細胞、およびツメガエル卵抽出液において、Sororinの結合因子からDNA複製関連因子を同定し、Sororinローダーとしての機能の検証を試みる。ヒトSororin－GFPを恒常的に発現するヒト体細胞（HeLa細胞またはHCT116細胞）およびショウジョウバエDalmatian-GFP発現S2細胞の作製を行った。これと並行して、アフリカツメガエル卵抽出液からのSororin-GFPタンパク質を用いたプルダウンアッセイを行ったところ、複製因子C（Replication Factor C）複合体をはじめ、Sororin結合因子が複数同定された。すでにSororinとの結合が報告されているコヒーシン複合体サブユニットも複数検出されたことから、プルダウン系は正しく機能していると考えられる。しかしながら、核／細胞質比が体細胞と大きく異なるツメガエル卵抽出液では、DNA複製に関わる因子の濃度も低く、DNA複製期に接着を確立することが示唆されているSororinの機能を正しく解釈できない可能性が危惧された。実際、予備的な実験でSororinとの結合が検出されていたDNA複製因子の一部は再現性の良い検出が困難であり、核／細胞質比を増加させる必要がある可能性が示唆された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度、Sororinのローディングに必要な因子の同定を目的とし、Sororin結合因子の網羅的な同定を、ツメガエル卵抽出液を用いて行い、複数の因子を同定したが、細胞核内での結合因子をより的確に探索するため、核質成分をより濃縮させる必要があることが判明した。このことから、今後、細胞核抽出液を用いたSororin結合因子の探索を行う予定である。また、これら同定した因子の免疫除去（ツメガエル卵抽出液）やオーキシンデグロン法を用いた分解実験（ヒトHCT116細胞）を行い、接着・複製の表現型を明らかにする。また、すでに予備的な実験で同定されている因子の一つ、複製因子C（Replication Factor C）複合体の除去実験を行い、複製因子C の非存在下でSororinがクロマチンにリクルートされるか、また、複製にどのような影響がでるかを検証する。SororinのショウジョウバエオーソログであるDalmatianの結合因子の同定を引き続き継続し、同定された因子のショウジョウバエS2細胞におけるノックダウンを進める。標的因子のmRNAに結合するantisense RNAを合成し、S2細胞に取り込ませることによりノックダウンを行い、染色体スプレッド（chromosome spread）によって接着不全の表現型を解析する。また今後は、同定した因子とSororinあるいはDalmatianとの結合部位の生化学的な同定にも着手していく予定である。
|
