2021 Fiscal Year Annual Research Report
in vivo CRISPRスクリーニングの技術確立と生体内細胞増殖機構の解析
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21H04959
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
遊佐 宏介 京都大学, 医生物学研究所, 教授 (00813180)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
青木 一成 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (30618020)
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| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2025-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / CRISPR-Cas9 / Cre / スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
誘導型CRIPSR-Cas9システムの構築のためCre-lox組換えシステムを応用した。lox-STOP-loxカセット下流にCas9遺伝子を配置しpiggyBacトランスポゾンに組み込んだ。また、CreERT2発現ベクターもpiggyBacトランスポゾンに組み込み、ベクター系を構築した。両ベクターを多発性骨髄腫細胞株MM1Sに導入し誘導型CRISPR-Casシステムを有する細胞株を樹立した。
Cre発現ベクターには非侵襲的イメージングのためluciferase遺伝子も組み込み、生体内での腫瘍細胞の増殖をモニタリングできるようにしている。このin vivoイメージングを検証するため、上記の細胞を免疫不全マウスに移植しルシフェリンを投与後、新たに導入したイメージング装置FUSION-FX7を用いて解析した。結果、良好なシグナル検出が認められ、イメージングが適切に行えると判断した。
Cre-lox駆動型CRISPR-Cas9システムの検証を行うため、樹立した細胞をタモキシフェン処理し、組換え体を樹立した。Cas9の機能的発現を確認するため、マーカー遺伝子に対するgRNAを発現させた結果、標的遺伝子を高効率で不活化することができ、CRISPR-Cas9システムがCre-lox組換えにより誘導できることを確認した。
Cre-lox組換えの効率をさらに詳細に調べるため、タモキシフェンの濃度、処理時間を複数設定し、組換え細胞割合を調べた結果、いずれの条件においても高い細胞死を検出した。これはCreERT2が活性化したことによる毒性であると考えられる。マウス遺伝学では一般的にCreERT2が用いられるが若干の毒性は指摘されている。ヒト培養細胞においてもCreERT2は使用歴があるため毒性は許容範囲内であると考えたが、本システムにおいては予想以上の強い毒性を示し、組換え細胞を効率的に得ることができないと判明した。このことから、システムの再検討を次年度に行うこととした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
部位特異的組み換えシステムとCRISPR-Cas9ゲノム編集システムを組み合わすことで、誘導型ゲノム編集が可能であることが検証された。しかし、Creタンパク質のヒト骨髄腫細胞に対する強い毒性が認められ、Cre以外の部位特異的組換えシステムの検討を要することがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト細胞においてCre-loxシステムを用いようとする場合、その高い毒性が問題となることが明らかとなったため、異なる配列を認識するほかの部位特異的組み換えシステムを検討することとする。具体的には、vCre-loxとFlp-FRTの両システムを用い、毒性を回避しつつ、効率的な組み換えが可能かどうか検討する。
また、本研究では骨髄腫細胞の骨髄内での増殖にかかわる遺伝子の同定を目的としているが、腫瘍細胞と骨髄ニッチとの相互作用には、CXCR4-CXCL12を介したケモタキシスが重要であることが明らかとなっており、この相互作用にかかわる因子は骨髄内での腫瘍細胞増殖にも必須であると考えられる。そこで、急性白血病細胞株を用いケモタキシスに着目したin vitro CRISPRスクリーニングを実施し、この相互作用にかかわる因子の同定を目指す。
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