2022 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on molecular mechanism of effector-mediated establishment of host specificity in plant pathogens and their application
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21H05032
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高野 義孝 京都大学, 農学研究科, 教授 (80293918)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大木 進野 北陸先端科学技術大学院大学, ナノマテリアルテクノロジーセンター, 教授 (70250420)
尾瀬 農之 北海道大学, 先端生命科学研究院, 教授 (80380525)
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| Project Period (FY) |
2021-07-05 – 2026-03-31
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| Keywords | 植物病原菌 / 宿主特異性 / エフェクター / 炭疽病菌 / ウリ科作物 / 耐病性作物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、宿主特異性成立に関与する植物病原菌エフェクター（EPC1、EPC2、EPC3）の解析を起点に、エフェクターを介した植物病原菌の宿主特異性成立の分子基盤を解明することを目的とする。これまでにEPC1、EPC2、EPC3はいずれもベンサミアナタバコのPAMP誘導免疫を抑制する活性があることが明らかにしていたが、本年度はエフェクターEPC3について、メロンおよびシロイヌナズナにおいても、flg22が誘導する活性酸素生成を抑制することを明らかにした。また、EPC3のN末端側フラグメント（以降、EPC3-NDと呼ぶ）はEPC3全長と同様に免疫抑制機能が保持されていることを明らかにした。そこでEPC3-NDに対してNMRを利用した動的構造解析に取り組み、その解析条件の最適化に成功し、現在、NMRスペクトルの解析を進めている。一方、EPC1、EPC2、EPC3の標的候補探索に関しては、標的因子候補のリスト化を完了し、EPC1標的に関しては候補である免疫関連キナーゼに対する解析を実施している。また、EPC1、EPC2、EPC3、EPC4遺伝子の単一破壊株はキュウリに対する病原性は低下するが、その病原性は依然として一定度保持されている。そのため、4 遺伝子の多重破壊株を作出した。ウリ類炭疽病菌の多重破壊株の作出においては、確立したCRISPR-Cas9システムとCre-Loxシステムを組み合わせた高効率多重遺伝子破壊株作出系を用いた。作出した4重遺伝子破壊株はキュウリ、メロンに対する病原性をほとんど完全に失っていた。興味深いことに、4重遺伝子破壊株のベンサミアナタバコへの病原性は野生株と同等であった。これらの結果より、この4種のEPC遺伝子は、ウリ類炭疽病菌のキュウリ、メロンなどのウリ科作物に対する宿主特異性において決定的な役割を果たしていることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画どおり、発見しているEPCエフェクターの植物免疫抑制能に関する知見がさらに得られており、特にEPC3がメロンの活性酸素生成を抑制することを明らかにできた点は重要である。また、エフェクターの構造解析については、EPC3のN末端側フラグメント（EPC3-NDと呼ぶ）が植物免疫抑制能を保持することを明らかにし、その結果に基づきNMRによる構造解析に着手し、条件の最適化にも成功し、構造決定における最終段階に入っている。さらにEPC1に関しては、標的因子候補リストの中にある免疫関連キナーゼに焦点をあて、まず、ベンサミアナタバコ葉において、EPC1と当該免疫関連キナーゼを一過的に共発現させ、続く免疫沈降解析の結果、その相互作用を検出している。さらに、当該免疫関連キナーゼ遺伝子はウリ類炭疽病菌接種時にその発現が顕著に誘導されることを見出し、この結果は本因子がEPC1の重要な標的であることを示唆している。また、EPCエフェクター遺伝子の単一破壊株はキュウリに対する病原性は低下するが、その病原性は依然として一定度保持されている。そのため、4 遺伝子の多重破壊株を作出した結果、4重遺伝子破壊株はキュウリ、メロンに対する病原性をほとんど完全に失う一方、興味深いことに、4重遺伝子破壊株のベンサミアナタバコへの病原性は野生株と同等であった。本成果により、この4種のEPC遺伝子は、ウリ類炭疽病菌のキュウリ、メロンなどのウリ科作物に対する宿主特異性において決定的な役割を果たしていることを明らかにしている。また、オービクラクレード内の別種との比較ゲノミクス、トランスクリプトミクス解析より、宿主特異性に関する新規エフェクターの探索を実施しているが、本年度、その候補リストの作成を完了し、現在、遺伝子破壊株の作出中の段階である。以上より、本研究は非常に順調に進展していると評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究で新たに同定したEPC4も加えて、引き続きEPCエフェクターの機能および構造解析を推進していく。具体的には、ウリ科作物において当該エフェクターを一過的に発現させ、その発現葉における防御応答の状態を調査する。エフェクターの立体構造解析については、EPC3-NDのNMRスペクトルの解析を完了させ、その立体構造を解明する。さらに、NMR緩和時間の実験を行い、その解析結果から分子内部の運動性を議論する。また、作成されたエフェクターの標的因子候補のリストについては、その絞り込みをすすめ、選抜した候補については、確立しているウイルス誘導性遺伝子サイレンシング法（VIGS）を用いてメロンあるいはキュウリにおけるノックダウン解析を実施する。続いてノックダウンした個体における防御応答の状態を調べることで、EPCエフェクターの重要標的を明らかにする。EPC1の標的候補として、免疫関連キナーゼが絞り込まれているが、本因子に関してもVIGS法によるノックダウン解析を実施する。ウリ類炭疽病菌の宿主特異性に関わる未同定のエフェクターを同定するために、ウリ類炭疽病菌において発現するが他の近縁種では必ずしも発現しない推定分泌タンパク質遺伝子を網羅的に選抜しており、今後はこの候補遺伝子に対する網羅的な標的破壊解析を実施する。さらに、CRISPR-Cas9システムとCre-Loxシステムを組み合わせた高効率の多重遺伝子破壊株作出系を用いて、当該候補遺伝子の多重破壊株の作出と解析も実施していく予定である。一方、CuBIP5はHSP70 ファミリーに属することから、反応段階に応じて異なった複数のコンフォメーションを取ることが予測され、現在調製できた二量体のコンフォメーションとは異なったコンフォメーションで相互作用を確認する必要があり、そのための各種解析を実施する。
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Research Products
(9 results)
