2021 Fiscal Year Annual Research Report
Functional metabolites production in butyrate producing Faecalibacterium prausnitzii
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21J11100
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
丹野 広貴 東京農業大学, 生物産業学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2023-03-31
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| Keywords | 腸内細菌 / 酪酸産生菌 / 16S rRNA遺伝子 / 定量的PCR / 抗炎症性ペプチド / 抗炎症活性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まずデータベースに存在する全てのゲノムデータを取得し、クオリティを加味し絞り込んだ86菌株を対象に、全ゲノムの相同性解析を行った。その結果、これまでF. prausnitziiとして報告されていた菌株は種レベルで異なる8つの系統群に分かれることが示唆された。また、既報の論文中から主要な本菌の検出用プライマーを抽出し、NCBIのPrimer-BLASＴ及び人工的に合成した16S rRNA遺伝子を鋳型としたReal-time PCRによる定量を行った。その結果、プライマーごとに大きく異なる特異性を示し、幾つかのプライマーは特定の系統群を全く検出できない可能性が考えられた。更に特定の菌株が保持する16S rRNA遺伝子はコピー間の相同性が顕著に低く、その塩基置換は定量的PCRやメタ16S解析に利用される領域であるV1及びV6領域に集中していることが明らかになった。そのため、16S rRNA遺伝子を本菌およびその類縁菌の同定及び定量に用いるのは適切ではない可能性が強く示唆された。
次に、MAMの解析として既に抗炎症活性が報告されているA2-165株のMAMのアミノ酸配列を基に相同性検索を行ったところ、86菌株の全てがMAM産生に関わると考えられる遺伝子を保持していた。またそれらの系統解析の結果、全ゲノムの解析による系統群と同様に8つのグループに分かれ、特定の系統群に属する菌株はMAM遺伝子を２つずつ保持していることも明らかになった。次にそのデータを基にアミノ酸配列が大きく異なる4菌株由来5種類のMAMを選抜し、大腸菌に導入することで組換え体を取得した。また、培養条件の違いがMAM産生に与える影響を観察するため、3種類の糖源を用いてA2-165株のMAM遺伝子の発現量をReal-time PCRにより定量した。現段階では、培養基質の違いが MAM 産生へ与える影響は見られていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
これまで F. prausnitzii とされてきた菌種には多様な系統群が存在し、本菌の定量に用いられてきたプライマーの多くでその系統群による特異性の偏りがあったことから、多くの論文でF. prausnitzii が正確に定量されていない可能性を示した。更に、16S rRNA 遺伝子を本菌の定量に用いることの不確実性を明確な根拠をもって示すことができた。この結果は、今後本菌を定量する際のプライマーを検討する上で貴重なデータとなることが期待できる。また本研究のデータを加味し既存の論文結果を再度考察することで、系統群と疾患との関連性についてより深い考察ができるものと考える。
またin silico解析により、本菌が産生する抗炎症性タンパク質 (MAM) は先述した系統群ごとに一次構造が大きく異なることが明らかになり、機能性も大きく異なる可能性が考えられた。更にそれらの組換え体の取得を完了し、in vitro での抗炎症活性試験の準備を進めることができた。総じて、当初の計画以上の成果が得られたと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
16S rRNA遺伝子に代わる新規の分類マーカーとして、既報の乳酸菌やビフィズス菌などの分類に用いられているハウスキーピング遺伝子を抽出し、菌株間の相同性解析を行う。更にそのデータを基にプライマーを作製し、in silico, in vitro での特異性を確認する。また、組換え体により産生されたMAMの精製を行い、培養細胞を用いた抗炎症活性の評価をELISA法にて行う。
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Research Products
(8 results)
