2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of cell-penetrating anti-rabies virus neutralizing monoclonal antibodies
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21J13419
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
板倉 友香里 北海道大学, 国際感染症学院, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2023-03-31
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| Keywords | 狂犬病ウイルス / 抗体療法 / 細胞膜透過性ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【RABV免疫抗原の作出とマウスへの免疫】
RABVゲノム複製を担う因子の一つであるP蛋白質を抗体の標的候補とし、免疫抗原の作出を試みた。Hisタグ融合P蛋白質を発現、精製後、マウスに免疫した。また、HAタグ融合P蛋白質の発現細胞を用いて、抗P蛋白質抗体を検出するためのELISAを構築し、免疫したマウスにおける抗体産生を確認した。
【抗体クローンの選抜方法の検討】
今後取得するモノクローナル抗体の中から、P蛋白質に結合し、RABVのゲノム複製を阻害する抗体クローンを選抜する。第一スクリーニングとして、構築したELISAを実施し、P蛋白質に対する結合性を抗体クローンごとに評価する。また、第二スクリーニングとして、in vitro RNAポリメラーゼアッセイの構築を試みた。その結果、ウイルスゲノム複製を担う蛋白質の存在下で、RNA合成のシグナル増加が認められた。今後、構築したin vitro RNAポリメラーゼアッセイの至適条件を検討する。
【細胞膜透過性ペプチドの選抜】
抗体の細胞内移行に適した細胞膜透過性ペプチド（CPP: Cell Penetrating Peptide）とその付加部位を検討した。IgG抗体の、重鎖あるいは軽鎖のC末端に、6種類のCPPを付加し、計12種類のCPP付加IgG抗体を組換え蛋白質として作出した。標的蛋白質に対する結合性をELISAで評価した結果、全てのCPP付加IgG抗体は、CPPの付加により結合性が変化しなかった。また、免疫染色法、及びイムノブロット法により、CPPを付加した抗体が細胞内に移行することが確かめられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
免疫抗原作出において、当初想定していなかった技術的な問題の解決に時間を要したため、モノクローナル抗体の取得がやや遅れているものの、マウスへの免疫を完了し、P蛋白質に対する抗体が誘導されていることを確認した。一方、抗体クローンの評価系の構築、及び抗体の細胞内移行に適したCPPの評価は順調に進んでおり、モノクローナル抗体が取得でき次第、抗体クローンの選抜が実施可能である。したがって、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
既にP蛋白質に対する抗体産生を確認したマウスより、ハイブリドーマ法、およびB細胞分離培養法を用いてモノクローナル抗体の取得を進める。また、既に構築した評価系により、モノクローナル抗体のスクリーニングを実施し、RABVのゲノム複製を阻害する抗体クローンを選抜する。さらに、CPPを付加した組換え蛋白質として抗体を作製し、細胞内への移行性を確認後、RABV感染細胞における中和能を評価する。感染細胞でRABV増殖阻害を認めた場合、マウスを用いたRABV感染系において、作出した抗体の狂犬病治療効果を評価する。同時に、その他のウイルス蛋白質に対する抗体の作出を進め、最終的にRABV中和モノクローナル抗体のカクテル剤としての治療効果の評価を計画している。
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[Journal Article] Glu333 in rabies virus glycoprotein is involved in virus attenuation through astrocyte infection and interferon responses2021
Author(s)
Yukari Itakura, Koshiro Tabata, Kohei Morimoto, Naoto Ito, Herman M Chambaro, Ryota Eguchi, Ken-Ichi Otsuguro, William W Hall, Yasuko Orba, Hirofumi Sawa, Michihito Sasaki
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Journal Title
iScience
Volume: 25(4)
Pages: 104122
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Air-liquid interphase culture confers SARS-CoV-2 susceptibility to A549 alveolar epithelial cells.2021
Author(s)
Sasaki M, Kishimoto M, Itakura Y, Tabata K, Intaruck K, Uemura K, Toba S,Sanaki T, Sato A, Hall WW, Orba Y, Sawa H.
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Journal Title
Biochemical and Biophysical Research Communications
Volume: 577
Pages: 146-151
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] A novel nairovirus associated with acute febrile illness in Hokkaido, Japan.2021
Author(s)
Kodama F, Yamaguchi H, Park E, Tatemoto K, Sashika M, Nakao R, Terauchi Y, Mizuma K, Orba Y, Kariwa H, Hagiwara K, Okazaki K, Goto A, Komagome R, Miyoshi M, Ito T, Yamano K, Yoshii K, Funaki C, Ishizuka M, Shigeno A, Itakura Y, Bell-Sakyi L, Edagawa S, Nagasaka A, Sakoda Y, Sawa H, Maeda K, Saijo M, Matsuno K.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 12(1)
Pages: 5539
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] SARS-CoV-2 Bearing a Mutation at the S1/S2 Cleavage Site Exhibits Attenuated Virulence and Confers Protective Immunity.2021
Author(s)
Sasaki M, Toba S, Itakura Y, Chambaro HM, Kishimoto M, Tabata K, Intaruck K, Uemura K, Sanaki T, Sato A, Hall WW, Orba Y, Sawa H.
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Journal Title
mBio
Volume: 12(4)
Pages: －
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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