2023 Fiscal Year Research-status Report
Development of a novel in vitro skin sensitization assay with predictive ability comparable to animal studies
| Project/Area Number |
21K02070
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
黒瀬 光一 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (30280754)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
|
| Keywords | 代替法試験 / 免疫原性試験 / アレルギー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
我々が開発したRealtime PCR-Based-h-CLAT（RPB -h-CLAT）法において、昨年度までに、これまで24時間を要した被験物質の曝露時間を5時間に短縮することが可能となった。今年度はさらに被験物質数を増やし、有用性の検証を行った。その結果、2感作性マーカー遺伝子の使用で43被験物質中40種の感作性を正しく評価できることが判明し、動物試験であるmurine LLNAによる感作性評価との一致率は90.7％となった。
一方、化学物質の代謝活性化による感作性を検出可能にするために、代謝活性化に関わるcytochrome P450（CYP）分子種とP450 oxidoreductase (POR)とを安定的に共発現するTHP-1細胞株の樹立をめざし、昨年度までにPOR、 CYP1A1、 CYP2E1ならびにCYP3A5のcDNAをEpisomal発現 Vector でにそれぞれサブクローニングし、Episomal発現プラスミドを作製した。今年度は、CYP3A4発現Episomal プラスミドとPOR発現Episomal プラスミドを用いて、PORとCYP3A4共発現THP-1細胞の樹立を行った。共発現細胞においてPORとCYP3A4のmRNAが発現していることをrealtime RT PCRにより確認し、さらにCYP3A4の活性をP450-Glo CYP3A4 Assayを用いて確認した。共発現していないTHP-1細胞ではCYP3A4活性が認められなかったが、PORとCYP3A4の共発現細胞では十分なCYP3A4活性が認められた。この共発現株を用いてRPB -h-CLAT法により、数種類の被験物質を用いて感作性評価を行ったところ、正しく感作性を評価することができた。このことから、樹立したPORとCYP3A4共発現THP-1細胞は感作性評価に使用できると考えられる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
以下の理由により遅れていると判断した。
CYP／POR安定共発現細胞株の樹立数が当初の予定よりも進んでいない。
代謝活性化する化学物質の感作性評価を実施できていない
|
| Strategy for Future Research Activity |
1. CYP／POR安定共発現細胞種の樹立数を増やす。
2. 樹立したCYP／POR安定共発現細胞株を用いて、代謝活性化する化学物質の感作性評価を実施し、代謝活性化する既知の化学物質の感作性を正しく評価できるのか否かを確認し、化学物質の代謝活性化による感作性の評価手法を確立する。
|
| Causes of Carryover |
理由： 前年度未使用額があり、それを本年度中に使用しきれなかったことが、次年度使用額の生じた理由である。
使用計画： 使用費目は物品費、旅費等、本研究遂行において必要な経費に使用する。消耗品に関しては、実験のための試薬や培地とチューブやプレートなどの実験器具の購入に充てる。
|
