2021 Fiscal Year Research-status Report
Mechanical evaluation for articular cartilage based on molecular and crystal scaled structural analysis by Raman imaging
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21K03744
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
東藤 正浩 北海道大学, 工学研究院, 教授 (10314402)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 生物・生体工学 / 生体分子 / 医療・福祉 / 関節軟骨 / ラマン分光 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
関節軟骨の疾患である変形性関節症（Osteoarthritis: OA）は，日々の生活や外傷などによる過剰な力学的負荷が原因で発症する．高齢化が進む中で，この病態を十分に把握し，適切な診断を行うことが求められている．ラマン分光法は，光と分子振動の相互効果を利用した手法である．水分の影響を受けにくく，有機・無機両成分の成分解析を非侵襲的に解析できるという特徴をもつ．ラマンスペクトルには，測定対象の分子の種類，振動のモードがピークとして表れる．また、応力により分子間結合の強さが変化することで振動数が変化することから, ラマンシフトも変化する.先行研究ではブタ膝蓋骨から採取した関節軟骨試験片にラマンスペクトル解析を行い，力学的負荷に対する膝関節軟骨のラマンスペクトル応答について調査した．その結果より，軟骨を構成する成分についてラマンシフト変化の傾向を確認でき，軟骨組織の力学的評価法としての有効性を確認することができた.
本研究では, 実際の臨床の形に近い軟骨表面から圧力を与えて，その際のラマンシフト変化の傾向を調査することを目的とした. ラマン分光装置内で圧縮負荷を段階的に与えられる装置を作製し, 調査を行った. また得られた結果から今まで明らかでなかった軟骨部位によるラマンシフト変化の違いを調査した. 大腿骨, 脛骨, 膝蓋骨部軟骨のラマンシフトについて調査した. その結果，その結果, 3つの部位全てで軟骨組織に含まれるプロリン,フェニルアラニン , ピラノースのラマンシフトに負荷圧縮状態に対する有意差が確認された. ラマンシフトから軟骨組織の力学状態を評価する可能性を確認することができた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の令和3年度は，ラマン分光イメージングによる関節軟骨の分子スケール構造解析手法の構築を目的とした．関節軟骨表面にレーザー照射し，軟骨基質内のコラーゲンおよびプロテオグリカン，および軟骨下骨のミネラル成分であるアパタイトから生じるラマン散乱を分光計測する手法を考案し，この分光イメージングから軟骨内特性分布の検出を行い，下記の検討を目指した．
実際の臨床の形に近い軟骨表面から圧力を与えて，その際のラマンシフト変化の傾向を調査することを目的とした. ラマン分光装置内で圧縮負荷を段階的に与えられる装置を作製し, 調査を行った. また得られた結果から今まで明らかでなかった軟骨部位によるラマンシフト変化の違いを調査した. 大腿骨, 脛骨, 膝蓋骨部軟骨のラマンシフトについて調査した. その結果，その結果, 3つの部位全てで軟骨組織に含まれるプロリン,フェニルアラニン , ピラノースのラマンシフトに負荷圧縮状態に対する有意差が確認された. ラマンシフトから軟骨組織の力学状態を評価する可能性を確認することができた．この結果からラマン分光イメージングにより，軟骨内特性分布を検出する可能性を確認することができた．
予定では，若年（年齢6カ月）および老年（年齢5年）と年齢の異なるウサギ加齢膝試料を採取，また若年膝については，現有設備である卓上材料試験機（Instron4411, Instron）による圧縮過負荷を与えた損傷膝試料を作製する予定であったが，こちらは今後の課題とするが，全体としてはおおむね順調に進展していると判断する．
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度では，関節内診断を想定した圧縮負荷時ラマン分光解析による関節軟骨分子スケール力学解析手法の開発を目的とする．レーザー透過可能な円柱状のガラス製インデンタ（直径3mm）を開発し，ラマン顕微鏡対物レンズ先端に組み合わせ，圧縮負荷時の関節軟骨のラマン分光計測を実現する．具体的には下記の検討を行う．
荷重に応じた微視構造変化とともに，関節液が基質内を移動し，潤滑機能を高めているため，構成成分の力学挙動特性は軟骨機能評価に重要な情報となる．レーザー透過可能な円柱状のガラス製インデンタ（直径3mm）との組み合わせにより，圧縮負荷時の関節軟骨ラマン分光計測を実現する．レンズより照射されたレーザーはインデンタガラス底面を透過し，接触した軟骨表面に照射される．・内部で生じたラマン散乱を再びレンズを介して分光し，ラマンスペクトルを得る．申請のラマン顕微鏡用偏光測定キットを用い，力学的異方性を考慮した力学応答測定を行う．選定したラマン計測条件に基づき，圧縮負荷時のラマンスペクトルを計測し，圧縮負荷量と各成分のラマンピークパラメータの相関を調査する．
測定対象はウサギ膝関節とし，若年（年齢6カ月）および老年（年齢5年）と年齢の異なる加齢膝試料を採取する．若年膝については，現有設備である卓上材料試験機（Instron4411, Instron）による圧縮過負荷を与えた損傷膝試料を作製する．加齢および変性膝軟骨試料のラマン分光力学挙動を計測し，相関関係を明らかにし，関節軟骨力学的機能評価指標を提案する．
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| Causes of Carryover |
予定では，若年（年齢6カ月）および老年（年齢5年）と年齢の異なるウサギ加齢膝試料を採取，また若年膝については，現有設備である卓上材料試験機（Instron4411, Instron）による圧縮過負荷を与えた損傷膝試料を作製する予定であったが，本課題の進捗状況より本検討を今後の課題とすることとしたため，残額が生じた．本年度，本実験に使用予定であった動物試料購入費，および事件消耗品費として使用する計画である．
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