2021 Fiscal Year Research-status Report
Research for identification of rubber-decomposing gene which is included in rubber-decomposing bacteria
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21K04329
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| Research Institution | Kurume National College of Technology |
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Principal Investigator |
笈木 宏和 久留米工業高等専門学校, 生物応用化学科, 教授 (00290825)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ゴム分解微生物 / 変異体作製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ゴム分解微生物(Enterobacter MOE-1株、以下MOE-1株と記す)の変異体作製によるゴム分解遺伝子部位の同定、遺伝子組み換えによる機能特定と改良、およびそれを基にした低温でかつ安全に利用することのできる合成ゴム分解バイオリアクターの作製を行うための検討を行う。今年度はその第一段階として、ゴム分解能力喪失変異体の作製を試みた。紫外線を用いてゴム分解微生物にランダムな変異を起こし、得られた複数個の変異体群から、アルデヒドの生成能力の欠落した株を選別していった。
既設、および新規に購入したUVランプを用いて、照射前の1/100程度の個数になるようにシャーレに入れた菌液に紫外線を照射し、得られたコロニーのゴム分解能を測定することにより変異体の有無を判別した。
ゴム分解能喪失の有無は、当初は分解により生成するアルデヒドをシッフ試薬により染色して判別する予定であったが、同手法は測定に最低4～5日かかるため、今回はより迅速に、かつ正確に測定できるラテックス分解法が開発できたため、同法を用いて変異体の検出を行った。
その手順を以下に示す。マイクロプレートのウェルに、SBRラテックスを懸濁した無機培地を入れ、あらかじめLB寒天培地で再培養したコロニーをウェル中の無機培地にそれぞれ加え、30℃で24～48時間振とう培養後、目視、およびマイクロプレートリーダーにより吸光度の測定を行うことにより判定した。この時、ゴムが分解されて透明になった培地はゴム分解能を有していると判断し、ラテックスの分解が起こらず、透明にならないものを変異株として次の調査に用いる。
今年度の研究では、総計1500個程度のコロニーについて分析を行ったが、ゴム分解能欠損株を発見することはできなかった。同研究については、次年度もリアクター作成と並行して行っていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
変異体作成の実験には多くの変異体を作成する必要があるが、コロナウイルス蔓延による非常事態宣言に合わせて研究活動に制限が出ており、想定された実験を進めることができなかった。想定では、1万個程度のUV照射コロニーを分析することにより変異体が得られることを想定しているが、今回想定回数の実験が実施できず、変異体が得られなかった。遅れた内容は引き続き今年度も実施していく予定であるが、次のステップである遺伝子同定については予定がずれ込む可能性がある。この遅れを少しでも取り戻すために、後述のリアクターの作製を前倒しで並行して実施したいと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度に引き続き紫外線照射法によるゴム分解能の欠落した変異体の作製を行う。マイクロプレート法により解析速度が向上しており、速やかに多くの菌体の分解能解析を実施できるようになると思われる。早い段階で変異体を入手できた場合、変異体を単離したのち、全塩基配列を決定し、すでに配列が決定している野生株のそれと比較することにより、ゴム分解酵素遺伝子配列の特定を試みる。全塩基配列決定は、長岡技科大生物機能工学課程の笠井研究室所有の次世代シーケンサーを用いて行う予定である。
なお、研究の遅れをカバーするために、次年度に実施予定のゴム分解微生物を用いたリアクターの試作品作製にも同時に着手したいと考えている。リアクターはゴム分解菌の野生株を用いて、ゴムの分解をバッチ式で分解できるリアクターとして設計・構築を行う。これらは今年度中に設計・および仮構築ができるように計画を進めていく。
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| Causes of Carryover |
購入時の端数により差が生じたものです。次年度以降の購入で調整していきます。
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