Development of Escherichia coli catalyst with highly integrated excellent functions for high performance of microbial fuel cell

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K04796
• Research Institution: Osaka Metropolitan University
• Principal Investigator: 東 雅之 大阪公立大学, 大学院工学研究科, 教授 (20285282)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾島 由紘 大阪公立大学, 大学院工学研究科, 准教授 (20546957)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 微生物燃料電池 / バイオ燃料電池 / 微生物触媒 / 代謝 / MFC / 大腸菌

Outline of Annual Research Achievements

本課題では微生物（大腸菌）燃料電池に着目し、燃料をグルコースとした時の出力改善に向けて大腸菌の改変に取り組んでいる。先行研究では高い平均出力を示す5重遺伝子欠損株（Δ5株）を構築した。本課題では「染色体改変技術を用いた大腸菌への有用機能の集約」と「触媒の簡易評価システムの構築とそれを用いた有用変異のスクリーニング」からさらなる改善を進めている。これまでに、Δ5株にホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸への変換に関わる遺伝子ppcを導入した株では、平均出力は野生株より大きく低下するが、クーロン効率（C効率）は大幅に増加することを明らかにした。さらに、Δ5+ppc株にgalp遺伝子の過剰発現を組み合わせたΔ5+ppc+galp株を構築し、平均出力はΔ5株より僅かに低下するがC効率は逆に高くなることを示した。また、触媒評価システムの構築では、キノン系化合物HNQの酸化型（赤橙色）と還元型（無色）の色の違いより細胞からのメディエーターへの電子移動を目視で評価する系を構築した。
2022年度は上記研究を継続した。有用機能の集約では、Δ5+ppc株のppc発現量をプロモータの変異により弱めたΔ5＋ppc（30%）株を構築し評価した。その結果、Δ5株とほぼ同じ平均出力を示し、C効率はΔ5+ppc株より低いが、Δ5株より高い値を示した。この株のグルコース消費を高めるため、galPとglk遺伝子の過剰発現を組み合わせたΔ5＋ppc（30%）+galP+glk株を新たに構築した。平均出力はΔ5株とほぼ同じ値を示し、C効率は僅かに低下する傾向が見られた。簡易評価システムを用いたスクリーニングでは、新たに野生株をベースにランダムに変異処理を行い、得られた変異株をHNQの色の変化を指標とした系で1次選抜した後に発電評価を行った。2株で平均出力が向上し1株は野生株の1.3倍の平均出力を示した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題では、２つのアプローチから大腸菌の触媒としての機能を高めることを目標としている。「染色体改変技術を用いた大腸菌への有用機能の集約」に関する取り組みでは、先行研究で得たΔ5株を基準に有望株を選抜している。Δ5+ppc株ではΔ5株に比べ平均出力は低下したがC効率は大幅に向上することが分かった。また、プロモーターの変異によりppcの発現量を中程度弱めたΔ5+ppc(30%)株では、Δ5株と比べ平均出力はほぼ同等でC効率は高くなることが分かった。現状ではこの株が最も優れた株（触媒）となる。Δ5+ppc(30%)株をベースに、グルコース消費を高めるためにgalPとglk遺伝子の過剰発現を導入したが、グルコース消費は増加したものの平均出力は変わらずC効率が低下した。さらなる改変が必要と考えられる。また、上記以外にもΔ5株にロドキノン(RQ)合成に関わる嫌気的光合成細菌 Rhodospirillum rubrum由来のrquA遺伝子を導入した株を構築し評価したが、Δ5株から僅かにC効率が上昇する程度で平均出力には変化がなかった。Δ5株もしくはΔ5+ppc(30%)株をベースに今後も検討が必要と判断している。２つ目の触媒の簡易評価システムの構築とそれを用いた有用変異のスクリーニングでは、スクリーニン系は構築できたと判断し有望株のスクリーニングに取り組んでいる。野生株をベースにした場合は、平均出力が上昇する株を6株得ており、今後はこの中から1株を選び変異箇所の解析を行う予定である。Δ5株をベースにした変異株の取得では、まだ有望株が得られておらず継続してスクリーニングを進める。
以上、実験はおおむね順調に進んでおり、Δ5株を超える有望株という点では、C効率の改善が進んだ株が得られている。平均出力の改善については、2023年度の課題として取り組む。

Strategy for Future Research Activity

2023年度の「染色体改変技術を用いた大腸菌への有用機能の集約」については、Δ5+ppc(30%)株などをベースに、TCAサイクルを回してグルコース代謝を早めることを期待し、NADHから電子を奪う細胞膜局在酵素の遺伝子であるndhを過剰発現させ、平均出力の改善に取り組む。また、Δ5＋ppc（30%）+galP+glk株の出力の経時変化では、出力測定開始後の前半の出力はΔ５株より高くなるが、後半はΔ５株より低くなる傾向が見られた。後半の出力が低下する要因としてpH低下などが予想される。そのため、測定後半も高い出力を維持し結果として平均出力が上かることを期待し、Δ5＋ppc（30%）+galP+glk株の出力低下の要因について明らかにしそれを改善することを試みる。
「触媒の簡易評価システムの構築とそれを用いた有用変異のスクリーニング」では、平均出力がΔ5株を超える高出力変異株を取得するために、Δ5株をベースにしたスクリーニングを継続する。また、これまでに得た野生株をベースにして取得した高出力株については、平均出力とC効率を考慮して有望株を1株選抜してそのゲノムDNA配列の解析を行う。変異箇所の解析を進め出力に影響すると予想される変異が見つかれば、それらの変異をΔ5+ppc(30%)株などに導入し、変異を重ね合わせた株の出力評価を行う。上記から、C効率をΔ5株程度維持した上で平均出力が向上した株の取得を目指す。2022年度は成果報告を行わなかったが、2022年度分も含めて2023年度に報告する予定である。

Causes of Carryover

2022年度の物品費として消耗品の購入を予定していた金額の一部を繰り越し、その全てを本年度の東雅之の物品費(消耗品)に加えることにした。これにより、2023年度 の消耗品予算は東分と尾島分を合わせて、予定の1,000,000円から1,277,828円に増える。繰越金が生じた理由は、前年度の年度末に大学からの公費が増額されそちらを優先して使用したこと、触媒である大腸菌の菌株作製作業が予想より順調に進んだことなどがある。本年度は目的の株がまだ取得できていないこともあり有望変異の掛け合わせなど前年度にはない菌株作製作業が含まれる点や、前年度の公費の増額は期待できない点もあり、繰越金をそのまま 2023年度の物品費に加えた。