2022 Fiscal Year Research-status Report
等温PCRを用いた修飾塩基測定法の開発と在宅がん診断への展開
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21K04798
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| Research Institution | Tokyo University of Technology |
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Principal Investigator |
吉田 亘 東京工科大学, 応用生物学部, 准教授 (10599806)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 等温PCR / 修飾塩基 / グアニン四重鎖構造 / i-motif構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では等温PCRを用いて標的遺伝子中の修飾塩基を簡便に測定する方法を開発することを目的としている。これまでに血管内皮増殖因子（VEGF）プロモーター中に含まれるグアニン四重鎖(G4)構造と、その相補鎖で形成されるintercalated motif (i-motif)構造中のCpG配列中のシトシンがメチル化されると、これら構造の熱安定性が上昇することを示した。また、これらの領域がメチル化されていると、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による増幅効率が低下することも報告している。そこで、本年度は等温PCR法であるRecombinase Polymerase Amplification（RPA）法を用いて、VEGFプロモーター領域のCpGメチル化レベルを検出できるか検討した。まず、HeLaヒトゲノムDNAからVEGFプロモーター領域をPCRで増幅し、CpGメチル化酵素でメチル化したPCR産物を得た。メチル化PCR産物と非メチル化PCR産物を混合し、メチル化レベルの異なる鋳型DNAを調製した。これらを鋳型にRPAを行い、RPAの増幅効率が鋳型DNAのCpGメチル化レベルに依存して減少するか検討した。その結果、鋳型DNAのCpGメチル化レベルに依存してRPA効率が減少することが示された。次に、ヒトゲノムDNA中のVEGFプロモーター領域のCpGメチル化レベルをRPAの増幅効率を指標に測定できるか検討した。その結果、RPA増幅効率はゲノムDNA中のVEGFプロモーター領域のCpGメチル化レベル依存的に減少することが示された。つまり、RPAの増幅効率を測定するだけで、30分以内に標的領域のCpGメチル化レベルを測定できることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では等温PCRを用いて標的遺伝子中の修飾塩基を簡便に測定する方法を開発することを目的としている。これまでに、CpGメチル化によりG4構造やi-motif構造が安定化することを明らかにした。さらに、これらを鋳型とした場合、ポリメラーゼにより伸長反応が阻害されることを利用し、等温PCRであるRPAの増幅効率を測定するだけで、簡便に標的領域のCpGメチル化レベルを測定できることを明らかにしたため、おおむね順調に進展していると判断した。今後、他の修飾塩基が核酸の高次構造に与える影響を明らかにし、それら修飾塩基を検出する方法を開発する。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに、VEGF G4構造とi-motif構造がCpGメチル化により安定化する条件でRPAを行うと、その増幅効率が低下することを明らかにした。これまでの研究で、c-kitプロモーター中に含まれるG4構造がCpGメチル化により熱安定性が変化することを明らかにしている。ヒトゲノムDNA中にはG4構造形成配列が多数含まれることから、CpGメチル化により熱安定性が変化するG4構造やi-motif構造を明らかにし、それら領域のCpGメチル化レベルもRPAにより測定する方法を開発する。また、メチルシトシン以外の修飾がG4構造やi-motif構造に与える影響を解析し、これら修飾塩基も同様に測定できる方法を開発する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症の影響で予定通りの学会発表ができなかったため、次年度使用額が生じた。なお、令和5年度の直接経費としては物品費833,334円、旅費90,000円、その他10,000円を予定している。
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