2022 Fiscal Year Research-status Report
高速AFM/光ピンセット複合機を用いたSMCの液-液相分離の形成・破壊機構の解明
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21K04849
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
梅田 健一 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 特任助教 (60746915)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 高速AFM / DNA / 染色体維持構造タンパク質 / コヒーシン / SMC5/6 / 生体機能動態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コヒーシンやコンデンシンに代表される環状のモータータンパク質であるSMCは染色体の形成過程において重要な役目を担うが、その分子レベルの原理に関して不明な点が多い。そのため、高速AFMを用いて、サブ分子レベルでの現象を可視化し、原理解明を行うことを目的として研究を行っている。蛍光顕微鏡を用いた先行研究例では、DNAが宙に浮いた状態で実験を行うため、トポロジカル結合した分子の動きを可視化できるのに対し、高速AFMでは分子を基板に吸着させる必要があるため、うまくダイナミクスを可視化できない問題があった。この問題を克服するために、前年度の研究において、非特異吸着を防ぐことが可能な脂質膜を用いることで吸着力を抑制し、分子のダイナミクスを可視化することに成功した。しかし、吸着力を弱くした状態ではダイナミクスは見えるものの分子の構造が観察できないため、吸着力を強くすると分子が壊れてしまうという問題があった。2022年度において、脂質膜の組成と観察用のバッファー条件、分子のローディング条件などを最適化することで、DNAにSMCが結合した状態であっても長時間に渡って安定してサブ分子分解能イメージング可能な条件を見つけることに成功した。更に、SMCがDNAをトポロジカル結合するメカニズムとして、ヘッドから入る説とヒンジから入る説が未だに存在し、決着が付いていない状態にある。これを明らかにするために、ワイルドタイプと、加水分解を抑制したATPaseミュータントの実験結果を比較した実験を行い、SMCがDNAをエンブレースする真の描像を明らかにすることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
分子を壊さずに、サブ分子レベルでの構造とそのダイナミクスを可視化できる条件が見つかったため、今後はこの条件を用いて、論文投稿に必要な統計データの取得を行う。この条件を用いて、ワイルドタイプやATPaseミュータントの実験結果を比較したところ、ATPaseミュータントの場合のほとんどがヘッド結合なのに対し、ワイルドタイプはヘッド結合とヒンジ結合が50:50で存在するということから、DNAはSmc5/6のヘッド側からアクセスし、ヘッドドメインに結合した後に、ATP加水分解に応じて、ヒンジ側に移行することが示唆された。また、論文執筆に当たって、粗視化MD計算を用いた分子構造変化のシミュレーションを行っている。更に、近年I形の分子構造に関してはクライオEMで報告されているが、O形の構造はまだ明らかではない。そのため、クライオEMにより得られた分子構造のPDBデータ（Nucleic Acids Research, 50, 9505 (2022)）を元にして、分子に外力に印加し、構造変化を誘起し、AFMで観察されるO形コンフォメーションの分子構造の生成を行った。現在、パラメータなどの最適化を行っているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度に当たるため、確実に論文に投稿にできるように引き続き、論文執筆に必要な統計データの取得を行う。特に、近年Smc5/6は蛍光顕微鏡や磁気ピンセットを使って、DNAテザリングやループ押し出しなど起こすということで注目が集まっているが、サブ分子レベルでの機構に関しては未解明となっているため、高速AFMを用いてこうした現象を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
次年度に高額備品を購入する予定があり、予算が足りなくなる恐れがあるため。
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