2021 Fiscal Year Research-status Report
Presumption of statistical mechanical state distribution of 3D protein structure in solution states by crystallization
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21K04908
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
鈴木 良尚 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(理工学域), 准教授 (60325248)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 正英 金沢大学, 学術メディア創成センター, 教授 (20306533)
佐崎 元 北海道大学, 低温科学研究所, 教授 (60261509)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 沈殿剤フリー / 結晶構造解析 / グルコースイソメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「研究実施計画」において、初年度はニワトリ卵白リゾチーム（HEWL）斜方晶系結晶を使って、NaCl濃度を細かく刻んで結晶化し、Na+サイト周辺で、変化する電子密度のNaCl濃度依存性を明らかにする予定であったが、塩濃度の変化による構造変化よりも、温度変化による構造変化の効果が圧倒的に大きいという予定外の事実が判明したため、急遽確認作業に追われた。2022年度に実験を予定していて、予備実験を実施していたグルコースイソメラーゼ（GI）について、沈殿剤フリーの遠心濃縮によって得られた結晶を、SPring-8において90 Kで構造解析して得られた構造と、Protein Data Bank（PDB）に登録されている、硫酸アンモニウムによる塩析で得られた結晶による1XIBという構造を比較したところ、構成分子の平均二乗変位（RMSD）が0.234Åであった。それに対して、研究室線源で100 Kで構造解析した沈殿剤フリー結晶で得られた構造のとの間のRMSD は 0.075Åであったため、塩濃度による違いが明らかに出たと思っていた。ところが、念のため、硫酸アンモニウムの塩析結晶における構造の一つである4A8Iと比較したところ、RMSD = 0.072Åとなり、塩濃度による違いはなかった。4A8Iは100 Kで構造解析していたため、温度変化の方がはるかに大きかった。これらの結果から、再現性の良い、常温における沈殿剤フリーのタンパク質結晶構造解析法が必要となり、その過程で、蒸発によるタンパク質の新規結晶化法を開発できたためCrystals誌に論文化した。
また、タンパク質分子の単純化モデルとしてパッチ粒子の相互作用と結晶構造の相関について、シミュレーションした結果をScientific reports, Japanese Journal of Applied Physics誌に投稿した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
計画立案当初には予測していなかった温度変化による構造変化の寄与の大きさが、HEWL結晶だけではなく、GI結晶ならびにそれ以外の一般的なタンパク質についての構造の沈殿剤濃度依存性の議論で無視できなくなったことによる。
HEWL結晶と異なり、GI結晶においては、分子構造に沈殿剤としてのイオンが構造として入り込まないため、塩濃度の違いによる本質的な構造変化についての議論が難しい。そこで、RMSDの違いを定量的な構造変化のパラメタとしたが、局所的な変化を議論するためには骨格分子のみならず、結晶水の分布等も含めた見直しも必要であり、計画を再考する必要が出てきたことによる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、まず線源の違いや、結晶の個性などによるばらつきを極力抑えるため、同じ結晶で常温での測定後、低温で測定し、その違いがどの程度あるかを確認する必要がある。これらについては、常温では調湿のため密閉した状態で測定する必要があるのに対し、低温では閉じた空間の中でのflash coolingは難しいため、密閉した状態で、ループ上に結晶を配置して構造解析したのち、ループを取り出して極低温測定を行う必要があり、その技術開発も必要である。これについては2022年度に本格的に取り組む。
その一方で、当初の計画であったHEWLについて、塩濃度による構造変化の測定についても同時進行で進めていく予定である。また、2022年度は研究室におけるテーマにおいて、科研費関連テーマの割合を大幅に増やし、物理的に研究の進捗をはかどらせる予定である。
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| Causes of Carryover |
当初，2021年度は通常の学会開催なども増え，通常通りに予算執行ができると考えていた。しかし，結果的には参加予定の学会が全てオンラインとなり，見込んでいた旅費が使用できなかった。この現状と課題申請時に参加予定していた国際会議が１年延期になったことを踏まえ，無理に予算計画を変更して使用はせずに，この学会の参加への使用なども考えている。
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