2023 Fiscal Year Research-status Report

小分子を用いたG-quadruplex領域のゲノムワイド検出法の開発

Research Project

Project/Area Number	21K05114
Research Institution	Kyushu Institute of Technology
Principal Investigator	藤井聡九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 助教 (40452825)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	竹中繁織九州工業大学, 大学院工学研究院, 教授 (60188208)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2025-03-31
Keywords	G4特異的結合試薬合成 / G-quadruplex（G4） / 熱力学的結合解析 / プルダウンアッセイ / qPCR
Outline of Annual Research Achievements	グアニンリッチなDNAは、1本鎖の同鎖内もしくは2本や4本の異鎖間でG-quadruplex（G4）と呼ばれる4重鎖構造を形成する。G4はヒトゲノム内ではテロメア部分に多く存在していることが知られているが、近年プロモーターや5'-UTR、スプライシングサイトなど様々な遺伝子調節領域においてもG4が形成され遺伝子調節に関わっていると言われている。しかし、生体中での詳細なメカニズムはほとんど解明されていない。また近年ゲノム及びトランスクリトームの研究は次世代シークエンサの登場により急速に発展している。そのような次世代シークエンス技術と核酸構造を検出する小分子という分析化学技術を組み合わせて、生体中におけるG4の形成領域をゲノムワイドに検出する手法を開発することを目的としている。本年度には、以下の研究を遂行した。 1)G4認識試薬cNDI-PEG4-Biotinの再合成を行い。c-myc, c-kit, CEGF, TA-coreのようなG4 DNAに対して熱力学的な結合解析を行った。その結果cNDI-PEG4-BiotinはG4に高い結合能を示し、c-mycに対して特に強い結合能を示した。 2)cNDI-PEG4-Biotinとストレプトアビジン磁気ビーズを利用したプルダウンアッセイによりcNDI-PEG-Biotin のDNAキャプチャー能評価を行い、4本鎖構造であるc-myc及びc-mycを含む120-merの配列を特異的にキャプチャーすることが示された。 3)また、プルダウンアッセイ後のqPCR解析により、c-mycを含む120-merの配列のものは大きく増幅が見られたが、c-myc-mut(変異導入配列)を含む120-merの配列はほとんど増幅が見られず、qPCRでもG4 DNAを特異的にキャプチャーしていることが確認できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 化合物によりG4 DNAのプルダウンをqPCRでまで確認できたことは良かったが、本来最終年度でシーケンサー解析を行う予定であったが、化合物の再合成を含めin vitroでの検討事項に手間を取られ到達できなかった。
Strategy for Future Research Activity	cNDI-PEG4-biotinのゲノムワイドに結合サイトをシークエンサ解析を行い進めていく予定である。当初の予定であったChIP-Seq法ではかなりの量が必要とされるため、近年一細胞レベルでのクロマチン解析などに応用されているCUT&Tag法を採用して行う予定にしている。
Causes of Carryover	本研究の目的であったシーケンサ解析まで行えなかったため。cNDI-PEG4-biotinのゲノムワイド結合サイトを決定するための次世代シーケンサ解析の受託解析サービスに使用する計画である。