2021 Fiscal Year Research-status Report
miRNA制御核酸の機能を細胞単位で解析する技術の開発
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21K05123
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
平野 悠 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (70415735)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | microRNA / 細胞 / アンチセンス / 顕微鏡 / ncRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
microRNA(miRNA)は22塩基前後の短鎖ノンコーディングRNAであり、細胞内で増殖などの基本的な生命現象を調整している。miRNAの一部はがんなどの疾病を誘起することが知られていることから、miRNAに相補的な核酸であるアンチmiRNAオリゴ核酸(anti-microRNA oligonucleotides, AMO)は研究用試薬としてだけではなく医薬品としても期待されている。一般的に利用されている一本鎖のAMOは、細胞内にリポフェクションで導入されると核に蓄積する傾向があることが報告されていることから、細胞質で機能するmiRNAへの結合はわずかであると考えられる。一方、我々は、安定な二本鎖構造を有するAMOを開発し、高い活性を持つことを確認している。しかしながら、細胞内の動態や局在と活性との相関について評価する手法がないことが課題になっていた。そこで、本研究ではAMOの細胞内の局在および活性を評価するシステムを開発する。今年度は、蛍光標識した安定化二本鎖構造を含む核酸を合成して細胞に導入して細胞質および核における局在量の評価を試みた。具体的には、細胞内に導入して培養後に細胞質や核を分画して回収し、電気泳動などでそれぞれの画分に含まれる核酸を分析した。その結果、一本鎖のAMOはほとんどが分解されており、両末端に安定な二本鎖構造を有するAMOは分解されずに細胞質にも存在していることが明らかとなった。また、片側の末端に安定な二本鎖構造を持つAMOは、接続する末端により局在する傾向が異なることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、標識なしおよび蛍光標識した核酸を合成してリポフェクションで細胞に導入して培養後に、細胞質や核を分画して回収し、電気泳動などでそれぞれの画分に含まれる核酸を評価した。また、アンチmiRNAオリゴ核酸（AMO）への蛍光標識が細胞内への活性へ与える影響を評価した。その結果、安定化した二本鎖核酸を接続することで、AMOの細胞質における局在量が増加する可能性が示唆された。また、一本鎖核酸においては蛍光標識により活性の変化が見られたが、安定化した二本鎖核酸を含むAMOは蛍光標識に関わらず同様の活性となることが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
安定化した二本鎖を接続した一本鎖核酸は、修飾に依存して細胞質に局在する傾向が明らかとなった。そこで、細胞質における局在とmiRNA抑制活性の相関について調べる。また、、安定化核酸の接続位置、二本鎖のサイズや配列、一本鎖部分の配列、末端修飾などの化学修飾についても同様に検討する。これにより、構造や配列の異なるオリゴ核酸の細胞内動態に関する知見を集積し、より低濃度で作用する化学修飾を抑えた機能性核酸の開発に繋げる。
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| Causes of Carryover |
昨年度研究中に、一本鎖修飾核酸の細胞内局在における予期せぬ結果が得られたことから、計画を変更し事前準備などをやり直したため。
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