2021 Fiscal Year Research-status Report
オンライン還元反応を用いた測定対象物の構造に依存しない蛍光誘導体化LC定量法
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21K05135
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
能田 均 福岡大学, 薬学部, 教授 (20164668)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂口 洋平 福岡大学, 薬学部, 助教 (10712507)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 蛍光誘導体化 / 液体クロマトグラフィー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛍光検出法は、LC分析における検出法の一つであり、LC-質量分析（MS）が主流となった現在においても、その検出感度、選択性、汎用性の高さから利用することも多い。その際、測定対象とする化合物は、蛍光性を持つものが少ないため、蛍光物質を測定対象物へ化学修飾する蛍光誘導体化法が用いられる。蛍光誘導体化法を用いることで、無蛍光性の測定対象物であっても、構造中に反応活性部位があれば、蛍光検出が可能となる。そのため現在では数多くの蛍光誘導体化試薬が開発、市販されており、あらゆる化合物に対して適用可能となっている。しかし、測定対象物の構造内に重原子や強力な電子求引基もしくは、別の蛍光性を持つ化合物は、重原子効果または蛍光共鳴エネルギー移動により減光または消光する場合がある。このような場合、高感度な分析が難しいため、蛍光分析には不向きとされていた。またこれらの官能基が存在しない場合でも、測定対象物の構造から少なからず影響を受けるため、同じ蛍光物質を誘導体化した場合でも、測定対象物によってそれぞれ異なる蛍光強度が得られる。そのため、通常のLC分析と同様に、測定対象物それぞれ個別の標準品が必要となる。これらの問題点は、蛍光物質特有の現象が起因するものであり、現状の蛍光誘導体化LC分析法では解決することは難しい。今回提案する蛍光誘導体化-LC法は、ジスルフィド結合を有する蛍光誘導体化試薬を、測定対象物へ誘導体化し、LC分離後、オンライン還元反応を行うことで、検出する蛍光物質を単一の化合物に規格化するものである。これにより、測定対象物の構造に依存しない検出が可能となり、これまで蛍光誘導体化が適用できなかった物質（重原子または強力な電子求引基を含有する物質）への適用や、個別の標準品を必要としない定量が可能となる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、蛍光誘導体化試薬の合成、本分析システムの構築及びモデル化合物であるアミノ酸を用いた定量性の確認を行い、次の点について明らかにしている。まず、①合成、精製した蛍光誘導体化試薬は、質量分析計により予想される構造であることが確認された。また、本誘導体化試薬を用いてモデル化合物であるアミノ酸へ誘導体化が可能であった。②アミノ酸誘導体及び本誘導体化試薬を用いてオンライン還元条件の最適化を行い、還元反応が完全に進行し、いずれのアミノ酸誘導体から単一の蛍光物質が生成することを確認できた。③本システムの定量性を確認するため、アミノ酸分析法及び安定同位体希釈－質量分析法により得られた定量値と本システムにより得られた定量値とで比較した。その結果、得られた二つの定量値が標準偏差内で一致することが確認された。①②③から、本システムを用いることで、測定対象物の構造に依存しない定量が可能であることが示唆された
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度において対象とした化合物は、アミノ酸2種のみであり、さらに適用範囲拡大が必要となる。そこで、通常の蛍光誘導体化LC分析法で適用ができない物質（例えばヨウ素、臭素などが結合された医薬品やアミノ酸であるトリプトファンなど）へ適用し、蛍光検出できるかを検討する。また、その与える蛍光強度が測定対象物の構造に依存しないかを検証する。
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