• Search Research Projects
  • Search Researchers
  • How to Use
  1. Back to project page

2021 Fiscal Year Research-status Report

Structural analysis of L-amino acid oxidases with strict substrate specificity

Research Project

Project/Area Number 21K05278
Research InstitutionOkayama University

Principal Investigator

稲垣 賢二  岡山大学, 環境生命科学学域, 教授(特任) (80184711)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 今田 勝巳  大阪大学, 理学研究科, 教授 (40346143)
Project Period (FY) 2021-04-01 – 2024-03-31
KeywordsL-リシン酸化酵素 / L-グルタミン酸酸化酵素 / 基質認識機構 / 成熟化機構 / 飽和変異 / X線結晶構造解析
Outline of Annual Research Achievements

糸状菌L-リシン酸化酵素(LysOX)と放線菌L-グルタミン酸酸化酵素(LGOX)は基質特異性が厳格であるため,バイオセンサーとして利用されている。最近我々はLysOXが大腸菌において微弱な活性を示す前駆体として発現し,N末端77残基のプロペプチドが切断されて,耐熱性と活性が向上することを明らかにした。LysOX成熟化機構を解明するため前駆体と基質複合体のX線構造解析を行った。その結果プロペプチドが基質認識に重要な残基を含むヘリックスに構造変化を誘起し, 活性が阻害されていることが判明した。さらに高濃度基質存在下ではプロペプチドがディスオーダーし, 成熟体と同じ構造で基質を認識する事が判明した。また基質認識に最も重要な活性中心残基Asp212への飽和変異導入により,本残基側鎖負電荷がリシンに対する高い触媒効率と厳格な基質特異性に寄与することが示された。基質側鎖の認識に重要な水素結合ネットワークを構成するAsp315に関しても,変異により活性と基質特異性に変化が見られたため重要であることが分かった。構造比較解析と変異導入解析により,Trp371は高基質特異性のL-アミノ酸酸化酵素(LAAO)に共通して存在しており活性中心のゲートとして基質の取り込みと固定に重要であることが示された。一方, L-グルタミン酸酸化酵素(LGOX)についてはR305E変異酵素がL-アルギニンに対して厳格な基質特異性を示し, L-アルギニン定量に有用であることが示された。さらにX線結晶構造解析の結果, 基質のグアニジノ基はGlu305, Asp433, Trp564, Glu617により認識されていた。新たにLGOXにおいて基質認識に関与する可能性が見出されたGlu617に飽和変異導入を行った結果,活性の低下と基質特異性の変化が見られ,本残基は厳格な基質認識に関与する残基であることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

LysOXとLGOX両酵素において,厳格な基質特異性に寄与する活性中心残基の機能が明らかとなった。LysOX前駆体と成熟体の諸性質の解析及び比較により,前駆体はプロテアーゼによるプロペプチド切断を経て活性化すると共に構造安定化することが明らかとなった。さらに,X線結晶構造解析に基づきプロペプチドによる活性阻害及びLysOXの成熟化機構を解明した。LGOX前駆体に関しても結晶を取得できたため,今後のX線結晶構造解析が期待される。

Strategy for Future Research Activity

LGOX前駆体のX線結晶構造解析を行い,成熟体酵素(PDB ID: 2E1M)と構造比較解析することで,LGOXの活性化及び基質親和性や熱・pH安定性の向上機構を解明する。さらにプロッセシングに関与するプロテアーゼを単離精製し,特性解析を行う。高基質特異性LysOXとLGOX,幅広い基質特異性の蛇毒由来LAAOの構造比較解析及び部位特異的変異酵素の解析によりLAAOの基質認識機構を明らかにし,それを基に基質特異性の改変や厳格化を行うことで新規LAAOの創出を試みる。

Causes of Carryover

予定した学会がオンライン開催になったため, 必要経費が少なくて済んだ。次年度は対面開催が再開される予定なので, 使用する。

  • Research Products

    (14 results)

All 2021

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (12 results)

  • [Journal Article] Structural basis of enzyme activity regulation by the propeptide of L-lysine α-oxidase precursor from Trichoderma viride2021

    • Author(s)
      Kitagawa Masaki、Ito Nanako、Matsumoto Yuya、Saito Masaya、Tamura Takashi、Kusakabe Hitoshi、Inagaki Kenji、Imada Katsumi
    • Journal Title

      Journal of Structural Biology: X

      Volume: 5 Pages: 100044~100044

    • DOI

      10.1016/j.yjsbx.2021.100044

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] A new L-arginine oxidase engineered from L-glutamate oxidase2021

    • Author(s)
      Yano Yoshika、Matsuo Shinsaku、Ito Nanako、Tamura Takashi、Kusakabe Hitoshi、Inagaki Kenji、Imada Katsumi
    • Journal Title

      Protein Science

      Volume: 30 Pages: 1044~1055

    • DOI

      10.1002/pro.4070

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] ダイズ由来L-メチオニン γ-リアーゼGmMGL1, 2, 3 の大腸菌発現系構築,精製と性質検討2021

    • Author(s)
      横山大輝,大川敦司,手嶋琢,松井健二,田村隆,稲垣賢二
    • Organizer
      日本農芸化学会中四国支部第61回講演会
  • [Presentation] 糸状菌Trichoderma viride由来LysOXの変異による基質特異性変換の機構2021

    • Author(s)
      上田悠加,松田崚汰,齋藤雅哉,田村隆,稲垣賢二,竹川宣宏,今田勝巳
    • Organizer
      第94回日本生化学会大会
  • [Presentation] 放線菌由来L-メチオニン脱炭酸酵素の結晶構造に基づく反応機構の解析2021

    • Author(s)
      大川敦司,井上朝晶,尾上友基,志波智生,稲垣純子,田村隆,稲垣賢二
    • Organizer
      第94回日本生化学会大会
  • [Presentation] 高基質特異性L-リシンα-オキシダーゼの基質側鎖の認識に関与する残基の機能解析2021

    • Author(s)
      齋藤雅哉,赤井元気,松本侑也,上田悠加,松田崚汰,今田勝巳,根本理子,田村隆,稲垣賢二
    • Organizer
      第73回日本生物工学会大会
  • [Presentation] 大豆由来L-メチオニンγリアーゼの大腸菌発現,精製と性質検討2021

    • Author(s)
      大川敦司,手嶋琢,松井健二,根本理子,田村隆,稲垣賢二
    • Organizer
      第73回日本生物工学会大会
  • [Presentation] 高基質特異性L-グルタミン酸オキシダーゼの側鎖認識に関わる残基の機能解析2021

    • Author(s)
      中山夏女,矢野佳果,上田悠加,今田勝巳,田村隆,稲垣賢二
    • Organizer
      日本農芸化学会2021年度西日本・中四国・関西支部合同大会
  • [Presentation] L-メチオニン脱炭酸酵素の活性中心に存在するTyr残基の役割2021

    • Author(s)
      大川敦司,尾上友基,志波智生,田村隆,稲垣賢二
    • Organizer
      第62回日本生化学会中国・四国支部例会
  • [Presentation] Streptomyces属放線菌由来L-メチオニン脱炭酸酵素の活性中心残基の機能解析2021

    • Author(s)
      大川敦司,志波智生,稲垣純子,田村隆,稲垣賢二
    • Organizer
      第463回ビタミンB研究協議会
  • [Presentation] 放線菌Streptomyce sp.590由来L-メチオニン脱炭酸酵素Y421F変異体のX線結晶構造解析2021

    • Author(s)
      井上朝晶,橋本沙樹,大川敦司,田村隆,稲垣賢二,原田繁春,志波智生
    • Organizer
      第21回日本蛋白質科学会年会
  • [Presentation] Thermus thermophilus HB8 由来ジスルフィド異性化酵素を用いたタンパク質の高温再生法2021

    • Author(s)
      岡村華依,平島史崇,根本理子,金尾忠芳,稲垣賢二,田村隆
    • Organizer
      日本農芸化学会中四国支部第59回講演会
  • [Presentation] 高基質特異性L-グルタミン酸オキシダーゼの活性中心残基Glu617への変異導入による機能解析2021

    • Author(s)
      矢野佳果,松尾慎作,伊藤菜奈子,今田勝巳,日下部均,根本理子,田村隆,稲垣賢二
    • Organizer
      日本農芸化学会2021年度大会
  • [Presentation] 鞍掛豆 西山浸98-5由来L-メチオニンγリアーゼの発現精製と性質検討2021

    • Author(s)
      大川敦司,手嶋琢,松井健二,根本理子,田村隆,稲垣賢二
    • Organizer
      日本農芸化学会2021年度大会

URL: 

Published: 2022-12-28  

Information User Guide FAQ News Terms of Use Attribution of KAKENHI

Powered by NII kakenhi