2021 Fiscal Year Research-status Report
Structural analysis of L-amino acid oxidases with strict substrate specificity
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21K05278
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
稲垣 賢二 岡山大学, 環境生命科学学域, 教授(特任) (80184711)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今田 勝巳 大阪大学, 理学研究科, 教授 (40346143)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | L-リシン酸化酵素 / L-グルタミン酸酸化酵素 / 基質認識機構 / 成熟化機構 / 飽和変異 / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糸状菌L-リシン酸化酵素（LysOX）と放線菌L-グルタミン酸酸化酵素（LGOX）は基質特異性が厳格であるため，バイオセンサーとして利用されている。最近我々はLysOXが大腸菌において微弱な活性を示す前駆体として発現し，N末端77残基のプロペプチドが切断されて，耐熱性と活性が向上することを明らかにした。LysOX成熟化機構を解明するため前駆体と基質複合体のX線構造解析を行った。その結果プロペプチドが基質認識に重要な残基を含むヘリックスに構造変化を誘起し, 活性が阻害されていることが判明した。さらに高濃度基質存在下ではプロペプチドがディスオーダーし, 成熟体と同じ構造で基質を認識する事が判明した。また基質認識に最も重要な活性中心残基Asp212への飽和変異導入により，本残基側鎖負電荷がリシンに対する高い触媒効率と厳格な基質特異性に寄与することが示された。基質側鎖の認識に重要な水素結合ネットワークを構成するAsp315に関しても，変異により活性と基質特異性に変化が見られたため重要であることが分かった。構造比較解析と変異導入解析により，Trp371は高基質特異性のL-アミノ酸酸化酵素（LAAO）に共通して存在しており活性中心のゲートとして基質の取り込みと固定に重要であることが示された。一方, L-グルタミン酸酸化酵素（LGOX）についてはR305E変異酵素がL-アルギニンに対して厳格な基質特異性を示し, L-アルギニン定量に有用であることが示された。さらにX線結晶構造解析の結果, 基質のグアニジノ基はGlu305, Asp433, Trp564, Glu617により認識されていた。新たにLGOXにおいて基質認識に関与する可能性が見出されたGlu617に飽和変異導入を行った結果，活性の低下と基質特異性の変化が見られ，本残基は厳格な基質認識に関与する残基であることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
LysOXとLGOX両酵素において，厳格な基質特異性に寄与する活性中心残基の機能が明らかとなった。LysOX前駆体と成熟体の諸性質の解析及び比較により，前駆体はプロテアーゼによるプロペプチド切断を経て活性化すると共に構造安定化することが明らかとなった。さらに，X線結晶構造解析に基づきプロペプチドによる活性阻害及びLysOXの成熟化機構を解明した。LGOX前駆体に関しても結晶を取得できたため，今後のX線結晶構造解析が期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
LGOX前駆体のX線結晶構造解析を行い，成熟体酵素（PDB ID: 2E1M）と構造比較解析することで，LGOXの活性化及び基質親和性や熱・pH安定性の向上機構を解明する。さらにプロッセシングに関与するプロテアーゼを単離精製し，特性解析を行う。高基質特異性LysOXとLGOX，幅広い基質特異性の蛇毒由来LAAOの構造比較解析及び部位特異的変異酵素の解析によりLAAOの基質認識機構を明らかにし，それを基に基質特異性の改変や厳格化を行うことで新規LAAOの創出を試みる。
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| Causes of Carryover |
予定した学会がオンライン開催になったため， 必要経費が少なくて済んだ。次年度は対面開催が再開される予定なので， 使用する。
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Research Products
(14 results)
