2021 Fiscal Year Research-status Report
小胞体グルコース転移酵素が有するシャペロン機能の解析
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21K05282
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
武田 陽一 立命館大学, 生命科学部, 教授 (20423973)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | オリゴマンノース型糖鎖 / UGGT / 糖タンパク質品質管理機構 / EDEM3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
UGGTによる糖タンパク質のリフォールディングにおいて糖鎖構造依存性を明らかにするためには、様々な種類のオリゴマンノース型糖鎖を有する糖タンパク質基質を調製することが必要になることから、基質となるオリゴマンノース型糖鎖の大量調製法の検討を行った。また、得られた糖アスパラギンのアミノ基をFmoc化、カルボキシ基をにエチニル基を導入することで誘導化を行った。得られた糖鎖誘導体を、UGGTと同様に小胞体糖タンパク質品質管理機構において重要な役割を果たすEDEM3（ER Degradation Enhancing Alpha-Mannosidase Like Protein 3）の基質として利用し、in vitroで活性評価を行った。その結果、EDEM3はアスパラギン残基を有さないオリゴマンノース型糖鎖に比べてアスパラギン残基を有する糖鎖上のマンノース残基を好んで切断することを明らかにした。また、ERp46との複合化によってマンノーストリミングが増大することも示した。このように、調製した新規糖鎖基質は糖タンパク質品質管理機構の解析ツールとして有用であることを明らかになった。
糖鎖基質の調製に加え、UGGT1の発現系の検討も行った。これまで、ヒト培養細胞発現系で得られたUGGT1を用いてきたが、得られる量が少ないことや、活性にばらつきがあることが問題であった。今年度は昆虫細胞発現系でのUGGT1生産の検討を行い、高純度で高活性な組換えUGGT1調製法を確立した。さらに、得られたタンパク質の保存方法についても検討を行い活性を保ったまま、長期保存可能な条件を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定の酵素の大量調製に成功し、高活性であることも確認できた。また、調整した新規オリゴマンノース型糖鎖基質は糖タンパク質品質管理機構の解析ツールとして有用であることを明らかにした。
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| Strategy for Future Research Activity |
Selenofの発現系の構築とUGGT1との複合体の調製の条件検討が必要である。まずはシステイン型のSelenofを大腸菌発現系を用いて調製し、すで昆虫細胞発現系で得られているヒトUGGT1との結合を等温滴定熱量計などを用いて定量する。また、この複合体が、UGGT1単独に比べて糖タンパク質のリフォールディング効果を上昇させるか検討を行う。その後、セレノシステインを含むSelenofの発現系構築に向けて取り組む予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度にフラクションコレクターを購入する予定だったが、実験の進捗状況を考慮し、次年度以降に購入することにしたため、また、参加予定だった日本農芸化学会がオンラインで開催されたため、旅費等が生じなかったため、次年度使用額が生じた。
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